建立稳定表达荧光素酶的B16R细胞系

柯宗煌，王磊兰，高 卉*，刘滨磊

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.武汉滨会生物科技股份有限公司)

黑色素瘤虽然仅占所有恶性肿瘤的1%～3%，但以6%～7%的增长速度逐年增加，且发病年龄呈年轻化趋势，为发病率增长最快的恶性肿瘤之一[1]。随着生命科学技术的发展，免疫疗法成为肿瘤治疗的一大热门，其中包括溶瘤病毒疗法、PD1单抗和PDL1单抗疗法等。在这些肿瘤免疫疗法研究中，一些体外细胞杀伤实验和体内动物实验，用肉眼去计数细胞的存活数目或者观察计算动物肿瘤体积，这都将导致实验研究存在精确定量性和客观性的偏差[2]。因此，本研究采用黑色素瘤细胞系(B16R)，通过脂质体转染并筛选出能稳定表达荧光素酶的B16R-FLUC细胞系，用化学发光的方法进行荧光素酶基因的鉴定，并用C57小鼠进行皮下移植黑色素瘤实验，用活体成像系统进行拍照观察，检测B16R-FLUC细胞的成瘤性，从而为黑色素瘤药物临床前的体外杀伤实验和体内抑瘤实验提供了新的实验方法，进而为临床前研究黑色素瘤的发病机制和判断药物治疗效果提供了全新的技术手段[3]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物和细胞

C57小鼠购于湖北省疾控中心，B16R细胞(北京协和医学院赠与)。

1.1.2 试剂与仪器

DME/F12培养基购于Hyclone公司；胎牛血清购于四季青公司；嘌呤霉素购于赛国生物科技有限公司，异氟烷购于支诚生物公司，PBS购于JET公司，lipofectamine 3000转染试剂盒购于Thermo Fisher Scientific公司，PiggyBac-Dual-Promoter-Firefly Luciferase(PBDP-FLUC)重组质粒和PBDP转座酶(本实验室提供)。

二氧化碳培养箱购自日本松下公司，荧光倒置显微镜购自奥林巴斯公司，动物活体成像系统购于PE公司，多功能酶标仪和细胞计数仪购自赛默飞(Thermo Fisher Scientific)公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

从液氮罐中取一支B16R细胞复苏，细胞培养基为含10%胎牛血清DME/F-12，将细胞置37℃ 5%CO2的培养箱中培养，细胞汇合度达80%～90%时，进行传代。

1.2.2 脂质体转染

将生长状态良好的黑色素瘤细胞稀释至细胞密度为1×105个/mL，接种于六孔板中，每孔含10%胎牛血清的培养基体积为2mL，待六孔板中细胞汇合度为80%～90%时，弃去孔中培养基，加入新鲜配制的脂质体转染体系，其中脂质体5μL，带有荧光素酶基因和绿色荧光蛋白基因的重组质粒(PBDP-FLUC)10μL，PBDP转座酶40μL，充分混匀，再补加含10%胎牛血清的培养基2mL，置37℃ 5% CO2培养箱中培养，第2d观察转染结果。

1.2.3 稳定细胞株的筛选

对照组用连续硬膜外麻醉,侧卧,穿刺L3-4穿刺,针头进入硬膜外腔,分次将麻醉药物(1%利多卡因+0.2%地卡因)注入。

将六孔板中转染的B16R细胞于荧光显微镜下观察，视野下有20%～30%的细胞发绿色荧光，然后弃去原有培养基，补加含10%胎牛血清的培养基，并加入嘌呤霉素，使其最终浓度为5μg/μL，放入37℃ 5% CO2培养箱中培养，每隔2d更换一次培养基并加5μL浓度为1μg/μL的嘌呤霉素，并用荧光显微镜观察细胞发绿色荧光情况，待视野下发绿色荧光细胞比例达到80%以上，将六孔板中细胞消化下来，稀释细胞浓度至10个/mL，接种于96孔板中，第2d用荧光显微镜观察，将细胞全部发绿色荧光的孔作上标记，将96孔板细胞放入37℃ 5% CO2培养箱中培养，待已作标记的孔中细胞长满。

1.2.4 筛选细胞的扩大培养

将96孔板中的阳性细胞(B16R-FLUC)消化下来，接种于T75细胞培养瓶中，培养后如检测有Firefly luciferase高表达，则大量扩增B16R-FLUC细胞，待细胞长满后进行冻存，以备后续实验使用。

1.2.5 化学发光检测B16R-FLUC细胞荧光素酶基因的表达

将实验组B16R-FLUC细胞和对照组B16R细胞消化下来，用细胞计数仪计数，两组细胞分别按1×106个/mL、1×105个/mL、1×104个/mL稀释后，每种细胞浓度对应3个复孔，每孔取50μL细胞液加入96孔板(白板)，再向细胞中加入50μL荧光素酶底物，工作浓度为0.3mg/mL，避光条件下，将96孔板放入37℃ CO2培养箱中，孵育5～10min，用多功能酶标仪检测荧光值。

1.2.6 B16R-FLUC细胞体内成瘤性的检测

2 结 果

2.1 筛选细胞的扩大培养

由于B16R-FLUC细胞株中含有绿色荧光蛋白，故在荧光显微镜可观察到绿色荧光，如图1(封三)。嘌呤霉素筛选及单克隆筛选的细胞株生长状态良好，无污染，阳性细胞率高，待检测过表达Firefly luciferase后，可以大量扩增细胞，冻存细胞株，方便后续实验使用。

2.2 B16R-FLUC细胞荧光素酶基因的检测

筛选的B16R-FLUC细胞进行体外荧光素酶活性的检测，细胞浓度按1×106个/mL、1×105个/mL、1×104个/mL梯度，各取50μL，相对荧光强度(RLU)分别为2.9×105、2.163×104、1.764×103，显著高于对照组B16R细胞。B16R-FLUC细胞体外检测荧光素酶，相对荧光强度与细胞数呈现良好的相关性(R2=0.9996)，可见已经获得稳定表达荧光素酶的黑色素瘤细胞株。如图2。

图2 B16R-FLUC细胞荧光素酶基因的检测

2.3 B16R-FLUC细胞体内成瘤性的检测及评估

1×106个B16R-FLUC细胞皮下接种C57小鼠，3只C57小鼠成瘤均成功。在接种后的第7d，3只小鼠均长出明显的肿瘤，用活体成像系统能检测到肿瘤处较强的荧光信号，说明表达荧光素酶基因的B16R-FLUC细胞能在小鼠中成瘤，并能很好的反应肿瘤的生长情况，由此可建立荧光素酶标记的小鼠黑色素瘤动物模型，为以后黑色素瘤药物临床前研究的提供了合适的动物模型，见图3(封三)。

3 讨 论

生物发光成像技术是近年开发的一种直接测量活体动物中生物发光信号的新技术，实现了对小动物肿瘤模型实时连续性观察，能够在整体水平上动态监测动物中的肿瘤分布、生长情况[4-5]。荧光素酶是自然界中能够产生生物荧光酶的统称，在荧光素酶中加入对应的荧光素酶底物就可以发出荧光，而发出的光可以被光学显微镜探测到[6-7]。根据这一原理，本研究通过分子生物学技术，将表达荧光素酶基因的质粒通过脂质体转染到B16R细胞中，经过嘌呤霉素的筛选以及体外荧光素酶的鉴定，得到稳定表达荧光素酶基因的B16R-FLUC细胞株，并在C57小鼠皮下植瘤，通过动物活体成像系统检测B16R-FLUC细胞的成瘤性。实验结果表明，3只皮下接种B16R-FLUC细胞的动物均能成瘤，成功建立了荧光素酶标记C57小鼠皮下移植瘤模型。在抗癌新药临床前研究中，荧光素酶标记C57小鼠皮下移植瘤模型使肿瘤的生长状况可以用活体成像系统观察并进行量化，为客观评价抗癌新药的治疗效果提供了新的手段[8-11]。

综上所述，本研究利用生物学技术构建的稳定表达荧光素酶基因的B16R-FLUC细胞，并成功构建适用于小动物活体成像观察的C57小鼠皮下移植瘤模型，不仅为黑色素瘤药物临床前的体外杀伤实验和体内抑瘤实验提供了新的实验手段，而且为客观性评价抗黑色素瘤新药的治疗效果提供了实验基础。