鞘内给药SRT1720抑制炎症痛的病理机制研究*

张 凤，王煜嘉，谢 敏，朱海丽

(湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100)

炎症痛是一种慢性疾病，主要由组织损伤、化学刺激或自身免疫引起，其主要特征表现为疼痛超敏、异常性疼痛和自发性疼痛[1]。尽管疼痛的调节涉及多种因素，但脊髓胶质细胞的激活被认为是维持慢性疼痛的关键因素[2]。在中枢神经系统中，星形胶质细胞是数量最多且分布最广泛的神经胶质细胞，填充于神经元之间的空隙并包裹突触连接，有助于神经元回路的建立和重组，调节神经元活性，并维持突触结构[3]。炎症或组织损伤通过激活脊髓星形胶质细胞释放多种炎症细胞因子来参与疼痛的产生和维持，从而增加对疼痛刺激的敏感性[4]。沉默信息调节因子1(SIRT1)是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰转移酶[5]，研究发现SIRT1在多种动物疼痛模型中发挥一定的作用，包括炎症痛、神经痛和癌痛[6]。SIRT1激动剂处理明显改善鼠类的行为学，同时SIRT1沉默RNA加入可以逆转这种镇痛效果[7]。SRT1720是选择性SIRT1激活剂，属于喹喔啉甲酰胺盐酸盐的一种化学物质，分子式为 C25H23N7OS，通过氨基末端催化区的变构位点结合到SIRT1上从而发挥作用[8]。在本研究中，我们探讨鞘内注射SRT1720激活SIRT1对炎症痛的抑制作用，并研究其对胶质细胞和脊髓炎症的作用，从而为镇痛药物的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验中使用的动物为Sprague-Dawley(SD)大鼠，购于湖北省实验动物中心(中国武汉)，体重160～200g，6～8周龄，共18只随机分为3组，每组6只。正常对照组(Control)、模型组(完全弗氏佐剂，CFA)、SRT1720治疗组(CFA+SRT1720)。

1.2 主要试剂

SRT1720(Sigma-Aldrich)，加强型RIPA lysis buffer(碧云天)，蛋白酶抑制剂cocktail(Sigma-Aldrich)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)；anti-SIRT1(1∶1000，A0127，ABclonal Technology)，anti-pSer47-SIRT1(1∶1000，PA517391，Thermo Fisher)，anti-GFAP(1∶1000，A19058，ABclonal)，anti-β-actin(1∶5000，A1978，ABclonal)。

1.3 实验方法

1.3.1 构建大鼠炎症痛模型

模型组(CFA组)、SRT1720治疗组(CFA+SRT1720组)大鼠通过从大鼠左足底注射100μL CFA的方式来建立大鼠慢性炎症痛模型，正常对照组(Control组)大鼠足底注射100μL生理盐水。

1.3.2 鞘内注射给药

将SRT1720治疗组大鼠背部剃毛、碘伏消毒后，微量注射器于L5和L6椎骨棘突间隙垂直进针，当出现空洞感时证明注射器已进入蛛网膜下腔，此时将注射器由垂直倾斜至45°缓缓推入药物，注射完毕后，取出微量注射器，按压注射部位约1min，以免药物流出。SRT1720溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，使用前用生理盐水(1∶1)稀释。CFA+SRT1720组给药SRT1720 10μL，浓度为1.0mg/kg，正常对照组和模型组大鼠注射相等容量的DMSO+生理盐水。

1.4 检测方法

1.4.1 50%缩足阈值(PWT)检测

各组给药后0、1、3、6和24h，根据up-down法检测50%PWT。方法如下：将动物放置于行为测试笼内，当动物处于安静状态时，用Von Frey纤维(0.4～26 g)对大鼠后足底正中部进行垂直剌激，刺激时纤维稍微弯曲2～3s即可，两次刺激之间间隔2min。动物在受到刺激后，若出现舔足或者抬足等行为视为阳性反应，反之则为阴性反应。阳性反应时，用相邻较低一级力度纤维进行刺激；阴性反应时，用相邻较高一级力度纤维进行刺激。在出现与前一次测试反应不一致结果时开始计数，记录6次数据后结束检测[6]。50%PWT(g)=(10[Xf+Kδ])/10000，Xf为本次行为学测试中使用的最后一个Von Frey纤维的阶数，K为痛觉阈矫正系数(可查表获得)，δ为相邻不同纤维刺激之间的差异，即0.224[9]。

1.4.2 蛋白质免疫印迹(Western blot)检测脊髓组织GFAP、SIRT1、p-SIRT1表达

大鼠麻醉致死，用眼科剪从中间分离脊柱，使脊髓显现出来，用解剖剪剥离脊膜，得到完整的脊髓，分离腰段脊髓。使用含有酶抑制剂的RIPA裂解液匀浆组织，4℃ 10000 rpm离心15min，取上清，加入三分之一体积的4×上样缓冲液，沸水浴加热10min，然后用BCA蛋白分析试剂盒确定上清中的蛋白质浓度。用SDS-PAGE分离蛋白质样品，然后电转移到PVDF膜，用5%的脱脂奶粉在室温下封闭1h，封闭结束后用TBS-T洗膜3次，每次5min，然后在4℃条件下Ⅰ抗孵育(GFAP、SIRT1和p-SIRT1)过夜。Ⅰ抗孵育之后，室温孵育Ⅱ抗1h。洗膜三次后用成像系统扫描观察，保存扫描图像并进行分析。Image J软件分析条带灰度值。以β-actin为内参，以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值计算GFAP、SIRT1、p-SIRT1蛋白相对表达量。

1.4.3 ELISA法检测脊髓组织TNF-α表达

取各组大鼠腰段脊髓组织，使用含有蛋白酶抑制剂混合物的PBS缓冲液(pH值为7.4)进行匀浆，将不同浓度标准品、样品各100 μl加入孔中，37℃ 90 min。反应后弃液，每孔100μL依次加入抗TNF-α抗体工作液，37℃ 60min。洗涤后，每孔加入100μL ABC工作，37℃ 30min。洗涤后，每孔加入90μL TMB显色液37℃避光反应25～30min。每孔100μL依次加入TMB终止液。用酶标仪在450nm测定OD值。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 SRT1720鞘内给药缓解CFA-炎症痛模型大鼠痛觉行为

足底注射CFA后，同侧大鼠后爪机械痛阈值降低(P<0.05)，SRT1720组在给药后1～24h机械痛阈值增加(P<0.05)，见表1。同时对侧大鼠后爪机械痛阈值没有统计学变化，见表2。

表1 各组大鼠同侧后爪PWT值比较

表2 各组大鼠对侧后爪PWT值比较

2.2 SRT1720鞘内给药激活脊髓SIRT1酶活

蛋白质免疫印迹结果显示CFA组SIRT1蛋白和磷酸化SIRT1表达均降低，见表3。SRT1720给药后CFA大鼠脊髓中均恢复了SIRT1磷酸化水平，代表SIRT1活性增加(P均<0.05)。

表3 各组脊髓组织p-SIRT1、SIRT1、p-SIRT/SIRT1、GFAP和TNF-α表达比较

2.3 SRT1720减轻脊髓星形胶质细胞活化并抑制脊髓炎症

蛋白质免疫印迹结果显示CFA组星形胶质细胞特异性胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达均上调。SRT1720给药后降低了GFAP的表达。同时采用ELISA法检测脊髓组织TNF-α表达发现，CFA诱导脊髓TNF-α表达上升，SRT1720给药后TNF-α表达下调(P均<0.05)，见表3。

3 讨 论

目前构建炎症痛模型的方法主要有四种：直接注入致炎剂造成局部炎症模型、注入佐剂造成佐剂性关节炎、注入Ⅱ型胶原造成关节炎和根据中医理论制作的肢体麻痹症模型。而其中CFA模型是目前认为最稳定、最理想的炎症模型。本实验采用从大鼠足底注入CFA构建炎症痛模型，足底注射CFA诱导脊髓背角(疼痛信息传递的重要部分)中星形胶质细胞和小胶质细胞标记物的免疫染色增加，并伴有热痛觉过敏和机械性异常性疼痛[10]。本文结果表现为CFA诱导后同侧大鼠后爪PWT值下降，机械痛敏增加；同时脊髓星形胶质细胞标记蛋白GFAP表达上调，表明外周CFA刺激诱导脊髓星形胶质细胞激活；进而，活化的脊髓星形胶质细胞会释放促炎细胞因子来延长并持续疼痛状态[2]。本文也显示CFA诱导脊髓促炎因子TNF-α的表达。

SIRT1在DNA损伤修复、抑制细胞凋亡、抵抗氧化应激和延长细胞寿命方面起着重要作用[11]。SRT1720是SIRT1的激活剂，已有研究表明它能够缓解多种代谢性及慢性疾病、治疗2型糖尿病、缓解哮喘等[12]。本文发现CFA诱导脊髓水平SIRT1表达和酶活均降低。SRT1720鞘内给药后激活SIRT1，并缓解炎症痛。

综上，本课题研究发现SRT1720激活SIRT1减轻脊髓星形胶质细胞活化并缓解炎症痛，具有重要的临床意义，为开发抗炎症痛药物提供了理论依据。