远程缺血中、后处理联合在自发性高血压大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用

鹿 欣 陈克彪 张志东 夏 涛 毕研玲

1.泰安市中心医院心脏外科； 2.泰安市中心医院介入放射科，山东 泰安 271000

缺血性心脏病治疗的主要策略是早期的再灌注和恢复血流。然而，再灌注本身会造成心肌组织的进一步损伤。在过去的40年之中，人们一直在寻找可以减轻缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)的策略。远程缺血处理[1]作为一种新的IRI的保护策略具有非侵入、简单易行的特点，它可以通过在肢体上放置的袖套式血压计的3～4个周期的充气(缺血)/放气(再灌注)实现对靶器官的保护。远程缺血中处理(remote ischemic perconditioning, RIPER)是在靶器官缺血的同时实施处理策略；远程缺血后处理(remote ischemic postconditioning, RIPOST)是在缺血后，靶器官复灌前实施处理策略。RIPER和RIPOST在不合并其他疾病动物上有强大的减轻缺血再灌注损伤的保护作用[2]。然而，RIPER和RIPOST的联合处理在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)中是否具有加强保护作用仍不明确。本研究主要观察RIPER和RIPOST的联合处理在SHR中是否仍具有保护作用；与单独使用RIPER和RIPOST相比，联合处理是否具有叠加保护作用；服用奥美沙坦4周是否影响RIPER和RIPOST的联合处理的保护作用。

1 材料与方法

1.1仪器(山东省动脉粥样硬化研究所提供)；BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟软件有限公司)；动物呼吸机：ALC-V8(上海奥尔科特生物科技有限公司)；Trizol提取试剂盒;microRNA抽提试剂盒;4S Red Plus核酸染色剂(BBI A606695)；H6-1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂)；FR980凝胶成像系统(上海复日科技有限公司)；SMA4000微量分光光度计(merinton)；PCR反应扩增仪(BIO公司)；移液器(加拿大 BBI公司)；全蛋白提取试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；BCA法蛋白质浓度测定试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；奥美沙坦酯：第一三共制药(上海)有限公司。

1.2动物选择及模型制备

清洁级雄性12周龄SHR 100只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006。用1.5%的戊巴比妥钠(45 mg/kg)行腹腔注射麻醉后，恒温电热板维持中心体温在36.0～38.0℃之间，将针形电极插入大鼠肢体皮下，连接心电图导联线，全程监测II导联心电图，并由心电图测算心率。心肌梗死模型参考既往文献[3]，沿前颈中线钝性分离皮下至气管旁软组织，剪开气管环半周，取16 G深静脉留置管修剪后插入气管约1 cm，打结固定，连接小动物呼吸机机械通气，呼吸频率60～70次/分，潮气量：3 mL/100 g，吸呼比1∶1。选取左侧3～5肋间开胸，剪开心包，于左心耳根部下方1 mm处进针，以6/0 prolene缝线穿过心肌表层，肺动脉圆锥旁出针，待心电图恢复稳定10 min后，取小段PE-50聚乙烯管放于结扎处以避免损伤冠状动脉，结扎左冠状动脉前降支(LAD)40 min。LAD阻断缺血40 min后，剪断聚乙烯管上方的结扎线，放置引流、排气，缝合胸腔，LAD复灌180 min。心肌缺血以心电图导联ST段明显抬高, 心肌颜色变暗为成功标志，再灌注以心外膜充血、心电图ST段逐渐恢复为标志。

1.3实验分组与处理

SHR按随机数字表法分为奥美沙坦5 mg/(kg·d)灌胃4周(Olm)及赋形剂(Veh)蒸馏水灌胃4周两部分，各部分单独分5组，每组10只。伪手术(Sham)组、缺血再灌注(IR)组、远程中处理(RIPER)组、远程后处理(RIPOST)组和联合(RIPER+RIPOST)组。Sham组：缝合线穿过大鼠的左冠状动脉前降支下方，但不阻断血流；IR组：对大鼠的左冠状动脉前降支阻断血流40 min后，给予180 min再灌注处理；RIPER组：左前降支阻断血流后，使用止血带阻断大鼠的左后肢血流，做3周期5 min缺血/5 min再灌注的远程中处理，余同IR组；RIPOST组：在复灌的同时，使用止血带阻断大鼠的左后肢血流，做3周期5 min缺血/5 min再灌注的远程后处理，余同IR组；RIPER+RIPOST组：在左前降支阻断血流后和复灌的同时，使用止血带阻断大鼠的左后肢血流，做3周期5 min缺血/5 min再灌注的联合处理，余同IR组。

1.4指标检测

再灌注180 min时，经左颈总动脉取血2 mL，以3 000 r/min离心15 min, 提取上清液, 以全自动生化分析仪检测CK-MB的含量。观察缺血和再灌注期间的心率变化、心律失常评分。实验结束末，再次开胸取出心脏，精密天平称重全心重量、左心室重量，计算左心室肥厚指数(LVMI)=左心室重量/体重。

TTC染色法测定心肌梗死面积，每个切片心肌梗死面积通过ImageJ1.37NIH，USA)分析。

取左心室前降支血管分布区(缺血再灌注区)心肌组织，铝箔纸包裹，标记后，放入液氮中速冻后转入-80℃超低温冰箱中冻存，qRT-PCR法检测HIF-1α、miR-21以及miR-210的mRNA表达。

1.5统计学处理

数值以均值±标准差的形式表示。两组之间的比较采用t检验，多组之间的比较采用One-way ANOVA分析和Turkey’s或者Dunnett’s方法两两比较。心律失常评分使用Mann-WhitneyU-test检验。各组之间的心率数值使用Repeated-Measures ANOVA 分析。统计分析使用SPSS 18.0数据分析软件。P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1CK

缺血再灌注损伤导致CK表达的增加(图1)。Vehicle-IR组(4 574.2±744.2)、vehicle-RIPER组(4 503.2±806.6)、vehicle-RIPOST组(4 693.6±763.8)以及vehicle-RIPER+RIPOST组(4 612.6±749.6)的CK值差异无统计学意义。在服用奥美沙坦的大鼠中，与对照组Olmesartan-IR(2 919.9±441.6)相比，RIPER、RIPOST以及RIPER和RIPOST的联合处理能显著降低CK值。Olmesartan-RIPER组(1 710.3±252.9)、Olmesartan-RIPOST组(1 908.3±270.2)以及Olmesartan-RIPER+RIPOST组(1 609.7±236.7)的CK值差异无统计学意义。

2.2心率以及心律失常评分

缺血再灌注期间各组的心率变化见表1。再灌注期间，各组的心率值之间无显著差异。心率随再灌注时间的延长有减慢的趋势。在服用奥美沙坦的大鼠中，与对照组Olmesartan-IR(1.7±0.7)相比，RIPER以及RIPER和RIPOST的联合处理能显著降低再灌注期间的心律失常评分。在服用奥美沙坦的大鼠中，RIPOST组心律失常评分(1.5±0.7)与Olmesartan-IR组相比差异无统计学意义。但是，再灌注期间Olmesartan-RIPER组(0.6±0.7)以及Olmesartan-RIPER+RIPOST组(0.5±0.5)的心律失常评分差异无统计学意义。

2.3血压与左室肥厚指数

服用奥美沙坦4周后，血压显著降低，左室肥厚明显减轻。与服用赋形剂组大鼠的收缩压(systolic blood pressure, SBP)、舒张压(diastolic blood pressure, DBP)以及LVMI的数值相比[(182.8±13.4),(135.1±15.2),(2.60±0.18)mmHg]，服用奥美沙坦大鼠的SBP、DBP以及LVMI的数值[(127.4±15.2),(92.1±13.8),(2.19±0.13)mmHg]显著降低。

2.4实验各组中风险区域和梗死面积

风险区域在各实验组中差异无统计学意义。梗死面积在服用赋形剂大鼠的各组中差异无统计学意义；在服用奥美沙坦后，梗死面积在Olmesartan-RIPER组、Olmesartan-RIPOST组以及Olmesartan-RIPER+RIPOST组中均显著降低，但3个处理组之间差异无统计学意义(图2)。

2.5HIF-1α、miR-21以及miR-210的mRNA表达

与服用赋形剂的大鼠相比，服用奥美沙坦的大鼠中HIF-1α、 miR-21以及miR-210的mRNA表达水平显著下调(图3～5)。与服用赋形剂的大鼠(Vehicle-IR组vs. Vehicle-sham组, 100/58.8)相比，IR损伤导致的HIF-1α上调的比值在服用奥美沙坦的大鼠中增加。在服用奥美沙坦的大鼠中，与Olmesartan-IR组相比，miR-21的表达和miR-210的表达在Olmesartan-RIPER组、Olmesartan-RIPOST组和Olmesartan-RIPER+RIPOST组中显著增加；并且在Olmesartan-RIPER+RIPOST组中进一步显著增加。

3 讨 论

IRI是一种病理生理过程。对缺血组织复灌后，会引起组织损伤的加重。与正常心肌相比，肥厚心肌在缺血再灌注之后更易受到长期的损伤和电生理紊乱[4]。与RIPER和RIPOST一样，RIPER和RIPOST的联合处理在高血压大鼠中失效。联合处理对减少梗死面积、CK、心律失常的发生均没有显著作用。高血压大鼠服用奥美沙坦之后，联合处理的作用得到恢复。与对照组相比，梗死面积减少38%，CK值减少45%。但是，与RIPER及RIPOST相比，联合处理不能进一步减少梗死面积和CK值。这与Wei等人[5]大鼠慢性心梗模型中验证的结论是一致的。

HIF-1α与预处理和后处理密切相关[6]，HIF-1α及其下游靶基因表达的上调具有心脏保护作用，miR-21以及miR-210是与HIF-1α有关的缺氧相关microRNA[7-8]，两者都具有抑制凋亡的作用，且外源性的增加两者的表达都能减少梗死面积。与RIPER组或RIPOST组相比，联合处理不能使HIF-1α的表达进一步提高。联合处理不能进一步减少梗死面积可能与HIF-1α的表达不能进一步提高有关。尽管RIPER和RIPOST的联合处理不能进一步减低梗死面积，但在联合处理组中，与RIPER组或RIPOST 组相比，miR-21及miR-210的表达进一步上调。Wei等人[5]在大鼠慢性心梗模型中证实：尽管联合处理不能进一步减低梗死面积，但能够进一步抑制炎症反应。中性粒细胞数量、巨噬细胞数量以及单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)的蛋白表达在联合处理组中均进一步减少。本实验则证实，在服用奥美沙坦之后，联合处理的保护作用得到恢复，尽管与单独使用RIPER或RIPOST相比联合处理不能进一步减小梗死面积，但能够进一步上调miR-21以及miR-210的表达水平，进而减少凋亡。

图2 各实验组中风险区域面积和梗死面积

A.服用赋形剂大鼠各组HIF-1的相对表达值；B.服用奥美沙坦大鼠各组HIF-1的相对表达值。*P<0.05与sham组相比, NS P>0.05与sham组相比, # P<0.05 与IR组相比，ns P>0.05 与RIPER组相比，$ P<0.05 与Vehicle-sham组相比。

A. 服用赋形剂大鼠各组miR-21的相对表达值；B.服用奥美沙坦大鼠各组miR-21的相对表达值。*P<0.05与sham组相比,#P<0.05 与IR组相比，NSP>0.05与IR组相比，nsP>0.05与RIPER组相比，￥P<0.05与RIPER组相比，&P<0.05与RIPOST组相比，$P<0.05 与Vehicle-sham组相比。

A. 服用赋形剂大鼠各组miR-210的相对表达值；B.服用奥美沙坦大鼠各组miR-210的相对表达值。*P<0.05与sham组相比, #P<0.05 与IR组相比， NSP>0.05与RIPER组相比，￥P<0.05与RIPER组相比，&P<0.05 与RIPOST组相比。

综上所述，RIPER以及RIPOST的联合处理在SHR中没有保护作用，奥美沙坦能够恢复RIPER以及RIPOST的联合处理在SHR中的保护作用，服用奥美沙坦之后，与单独使用RIPER或RIPOST相比，RIPER以及RIPOST的联合处理不能进一步减小梗死面积，但能够进一步上调miR-21以及miR-210的表达抑制凋亡。

致谢：感谢山东第一医科大学(山东省医学科学院)机能学实验室及山东省动脉粥样硬化研究所给予帮助。