苣荬菜中黄酮提取工艺改进及其抑菌分析

滕艾静 李宇飞 郭东会 孟 超 马清悦 路慧超 刘晓阳 刘 冰

1.山东第一医科大学(山东省医学科学院)生命科学学院，山东 泰安 271016；2.山东第一医科大学(山东省医学科学院)研究生院，山东 泰安 271016

苣荬菜(Sonchusarvensis)菊科(Compositae)，苦苣菜属(Sonchus)，是一种食药双用的多年生草本植物，分布广泛，性苦寒，全草均可入药，有抗炎、活血化瘀、抗菌等功效。苣荬菜的花、叶、种子等结构均可提取多种黄酮类化合物[1]。

黄酮(Flavone)又称黄碱素，是黄酮类化合物(Flavonoid)的总称，是植物的一种次生代谢产物。化学结构为两个具有酚羟基的苯环被中央三个碳原子相互连接在一起，通常以苷的形式存在。常用黄酮的提取方法包括索氏提取法、水浸提法、水蒸气蒸馏法、超声提取法等[2-4]。其中，超声提取法通过高频振动使细胞组织被破坏，从而促进黄酮的溶出和扩散，具有提取时间短、提取温度低、效率高等优点。黄酮具有多种生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗氧化等。苦苣菜中黄酮可以有效保护实验性肝损伤的功能[5]。大部分黄酮对大肠埃希氏杆菌和金黄色葡萄球菌等细菌有较为明显的抑制作用。

随着细菌的耐药性日益加重，黄酮的来源及抑菌作用也受到了关注。目前，对于苣荬菜的研究主要集中在其提取的生物代谢物性质的研究，对于黄酮的提取工艺改进和抑菌功能少见报道。本研究探索苣荬菜中黄酮的提取工艺优化，并分析了其抑菌作用。

1 材料与方法

1.1 仪器

V-5100可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)，离心机(L550cence湘仪)，旋蒸仪(RE-52A，上海亚荣生化仪器厂)，高速多功能粉碎机(永康市铂欧文五金制品有限公司)等。

1.2 实验材料

原材料为3月份采自泰山地区的苣荬菜。

1.3 试剂

盐酸，镁粉，硝酸铝，亚硝酸钠，氢氧化钠，芦丁标准品，蛋白胨，牛肉膏，琼脂，青霉素等。

1.4 方法

1.4.1样品制备

将采摘的新鲜苣荬菜洗净后，放置阴凉处晾干。用粉碎机将阴干后的苣荬菜粉碎，使用60目筛过滤2次后，将得到的苣荬菜干粉密封保存备用。

1.4.2超声提取黄酮

以乙醇为溶剂，利用超声提取法提取苣荬菜中的黄酮。用天平准确称取预处理的苣荬菜干粉1.00 g，设定超声功率为220 W进行超声提取。

1.4.3黄酮的定性

盐酸-镁粉法观察其显色反应。制备芦丁标准液，绘制芦丁标准曲线。

1.4.4总黄酮含量的测定

根据测得的芦丁标准曲线计算提取液中的黄酮含量。提取的黄酮为1.00 g原料中黄酮的质量(mg) 。

1.4.5单因素试验

参照文献，以黄酮提取率为指标，采用单因素法比较乙醇浓度(50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、提取时间(10、20、30、40、50 min)、提取温度(40、50、60、70、80℃)对苣荬菜黄酮提取率的影响，对比分析确定最佳的提取工艺。

1.4.6黄酮的抑菌试验

根据培养基配方制备黄酮类液体培养基的抑菌试验。激活并稀释冷冻的金黄色葡萄球菌溶液。将得到的黄酮提取液稀释至质量浓度为0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 mg/mL的溶液备用，无菌水(-)作为空白对照，青霉素(+)为阳性对照。抑菌试验采用滤纸法进行。制备固体培养基，并采用滤纸片法抑菌试验。将活化的金黄色葡萄球菌接种到固体培养基上，设置2个重复平板。将提取的黄酮稀释至质量浓度0.5、1、2、5、10 mg/mL的溶液，无菌水为空白对照，青霉素为阳性对照。

将同样大小的滤纸片浸泡到不同浓度的黄酮溶液中，并将其均匀地贴附在培养基表面，每个平板贴3片，做好标记，置于37℃恒温培养箱中倒置培养24 h后，取出观察结果，测量并记录抑菌圈的直径[6]。

1.5 数据分析

采用SPSS 22.0软件对数据进行方差分析，以P≤0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

绘制芦丁标准曲线如图1所示。

图1 芦丁标准曲线

由试验测定结果可得标准工作曲线Y=5.005x+0.003 2，R2=0.999 1(X为芦丁标准溶液的浓度，Y为吸光度)。结果可以看出，此范围内吸光度与芦丁质量浓度的线性关系良好。

2.2 超声提取黄酮的试验结果

2.2.1乙醇浓度对黄酮提取量的影响

乙醇浓度对黄酮提取量的影响见图2。准确称取样品粉末1.00 g于锥形瓶中，按料液比1∶30，分别选取50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，在50℃的条件下超声浸提40 min，超声波功率为220 W，考察黄酮提取率。

由图2可知，在乙醇浓度为50%～70%时，提取率较好。在浓度达到70%时，提取率最佳，超过70%时，黄酮得率下降。故由实验结果可确定乙醇浓度为70%时，对苣荬菜黄酮的提取相对较好。

图2 乙醇浓度对苣荬菜黄酮提取的影响

2.2.2料液比对黄酮提取的量影响

料液比对提取苣荬菜中黄酮含量的影响如图3。准确称取样品粉末1.00 g，按单因素实验所得的最佳乙醇浓度(70%)下，分别选取料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，在50℃下对其超声提取40 min，超声波功率220 W，考察黄酮提取率。

由图3可得，苣荬菜中所提取的黄酮的含量随着料液比的减小趋势为先增高后降低，当料液比为1∶30 时，黄酮的提取含量最高，提取量为 22.74 mg/g，因此选取料液比值为1∶30作为后续试验组别的料液比值。

图3 料液比对苣荬菜黄酮提取的影响

2.2.3提取时间对黄酮提取的影响

提取时间对提取苣荬菜中黄酮的影响见图4。准确称取样品粉末1.00 g于锥形瓶中，料液比(1∶30)，以最佳乙醇浓度(70%)，超声回流10、20、30、40、50、60 min，超声提取温度50℃，超声波功率220 W，测定黄酮提取率，根据实验数据作图。由图4可得，超声提取苣荬菜中黄酮的含量随着提取时间的增长呈先增高后降低的趋势，当提取时间是40 min时，黄酮的提取量最高，提取量为 22.74 mg/g，因此选择提取时间为40 min作为后续试验组别的超声提取时间。

图4 提取时间对苣荬菜黄酮提取的影响

2.2.4提取温度对黄酮提取的影响

超声波提取温度对提取苣荬菜中黄酮含量的影响见图5。准确称取苣荬菜粉末1.00 g于锥形瓶中，以乙醇浓度70%，最佳料液比1∶30，在40、50、60、70、80℃温度下超声提取，回流40 min，超声波功率220 W，测定黄酮提取率，根据试验数据作图。

由图5所示可得，超声提取苣荬菜中黄酮的含量随着提取温度的上升其变化趋势呈先增高后降低，当提取温度为70℃时，苣荬菜中黄酮的提取含量最高，提取量为 24.08 mg/g。

图5 提取温度对苣荬菜黄酮提取的影响

2.3 试验结果

按照上述单因素试验结果，超声提取苣荬菜中黄酮的最优提取工艺为：温度70℃，回流时间 40 min，乙醇体积浓度70%，料液比1︰30，最佳提取工艺下获得的黄酮含量是24.08 mg/g。

2.4 抑菌结果

2.4.1抑菌试验结果

按照抑菌圈试验判定标准：抑菌试验中抑菌圈的直径>20 mm属于极敏感，15～20 mm属于高敏感，10～15 mm属于中敏感，7～9 mm属于低敏感，<7 mm属于不敏感[7-8]。

抑菌试验结果如表1，提取自苣荬菜中的黄酮对金黄色葡萄球菌有抑制其生长的作用，且效果明显。黄酮的质量浓度分别为0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 mg/mL时，对金黄色葡萄球菌的抑制作用有显著差别。黄酮的质量浓度为1.00 mg/mL时，金黄色葡萄球菌有被抑制的效果，但并不明显。黄酮质量浓度为2.00 mg/mL时，金黄色葡萄球菌有被抑制的效果，且抑菌圈直径在7～9 mm范围内，属于低敏感。黄酮质量浓度为5.00 mg/mL时，金黄色葡萄球菌有被明显抑制的效果，抑菌圈直径在10～15mm范围内，属于中敏感。黄酮质量浓度为10.00 mg/mL时，金黄色葡萄球菌被抑制的效果十分明显，抑菌圈直径在15～20 mm范围内，属于高敏感。

表1 不同浓度的黄酮对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径(cm)

2.4.2最低抑菌浓度值结果与分析

苣荬菜中黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌抑菌浓度的结果和抑菌浓度分析见表1。苣荬菜黄酮对金黄色葡萄球菌的生长有抑制作用，黄酮的抑菌性随着黄酮质量浓度的增加而增强，苣荬菜中黄酮对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.50 mg/mL。采用SPSS 22.0软件对所得实验数据进行方差分析：P=0.048 875，结果具有统计学意义，即实验组别对金黄色葡萄球菌抑菌效果有显著影响；P=0.010 435，即黄酮浓度被认为对抑菌效果有显著影响，有统计学意义。

3 讨 论

由单因素试验结果得出，乙醇浓度、料液比、超声提取时间和温度对苣荬菜中黄酮的提取量均有一定的影响。超声提取苣荬菜中的黄酮，其含量随着料液比的减小呈现先增多后减少的趋势，分析原因可能是由于料液比的不同影响了乙醇的极性。超声提取苣荬菜中的黄酮，其含量随着提取时间的延长先增多后减少，分析原因为提取时间的增加有利于黄酮的溶出，但一定时间后黄酮类化合物逐渐分解，使得黄酮提取量降低。超声提取苣荬菜中的黄酮，其含量随着提取温度的升高呈先增多后减少的趋势，分析原因是由于一定的范围内升高温度有利于黄酮的提取，而持续升温则会导致黄酮水解。另一可能因素是黄酮自身具有还原性，高温会使黄酮变性[9]。

超声波提取可促使植物组织细胞破壁或者变形，通过高频振动破坏细胞的组织，有利于黄酮的溶出和扩散，增加黄酮的提取率。适应性比较广，适用于绝大多数材料中各成分的提取，有效成分易分离纯化[10-11]。

本实验证实了苣荬菜黄酮对金黄色葡萄球菌的良好抑菌效果。类似研究中，红景天乙醇粗提物中的黄酮可以抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌[12]，艾蒿总黄酮可选择性的抑制苹果腐烂病菌、黄瓜枯萎病菌等病原性真菌[13]。由于黄酮具有的抗菌作用，可应用在医用领域，为苣荬菜的综合利用提供了新的思路。