灯盏花素与牛血清白蛋白相互作用的光谱学研究

孙国章 ，何 莹，尹照瑞 ，黄庆玉 ，李凤丽

（1.天津天士力现代中药资源有限公司，天津300193； 2.天津雅昂医药国际化发展促进有限公司天津300193；3.天津市石天药业有限责任公司，天津300193； 4.天津天士力之骄药业有限公司，天津300193；5.天津中医药大学第一附属医院，天津300193）

血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白，能与多种外源性和内源性物质结合，发挥转运、存储等功能，即血清白蛋白调控着大多数物质在生物体内的分配过程［1］。血清白蛋白因其本身能结合药物并搬运至靶标位置的特性，备受化学医学领域、生物科学领域等研究者的关注［2-5］。因此研究药物与血清白蛋白之间的相互作用，有助于充分认识药物在体内的转运、分布、代谢及消除过程，阐明药物的作用机制和热力学特性，对药代动力学及药物的毒性都有非常重要的意义，也有助于新药的开发与优化。

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）和人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）结构极其相似，二者的同源性高达76.5%［6］，在水中的溶解性和稳定性与HSA 相比具有高度的相似性。BSA 简单易得，成本低，因此常被用作HSA 的可靠替代品。

灯盏花素（Breviscapine，BR）具有抗血小板聚集、扩张血管、增加血流量、改善微循环等药理作用，在治疗心脑血管疾病方面有良好的疗效［7］。目前BR 制剂广泛应用于临床，但在分子水平上研究BR 与生物大分子相互作用的文献报道甚少。本研究采用不同的光谱技术在拟生理（pH=7.4）条件下，研究BR 与BSA 之间的相互作用，一方面有助于了解BR 在人体内如何与血清白蛋白进行结合和转运；另一方面也为筛选优良的天然药物和药物分子的设计提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

日立F-4600 荧光分光光度计（天美科学仪器公司）；日立U-2910 紫外-可见分光光度计（天美科学仪器公司）；Chirascan Plus 多功能圆二色谱仪（英国应用光物理公司）；FA-2004N 电子分析天平（上海菁海仪器有限公司）；HH-501A 数显恒温水浴锅（常州亚特实验仪器有限公司），移液枪（上海荣泰生化工程有限公司）。

牛血清白蛋白（北京索莱宝科技有限公司，纯度≥ 99.5%，批号：1211Y054）；BR（湖南恒生制药有限公司，纯度≥ 98%，批号：HB20171102）；其他试剂均为国产分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

1.2 紫外-可见分光光度法

在编号为 1～10 的10 mL 棕色容量瓶中分别加入 0.1 mol/L 的 Tris-HCl 缓冲溶液 1.00 mL、2.0×10-5mol/L 的 BSA 溶液 1.00 mL，然后再依次加入 4.33×10-4mol/L 的 BR 溶液 0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90 mL，用双蒸水定容至10 mL，摇匀，静置30 min。待体系反应完全后，按照标号顺序依次将溶液加入1 cm 石英比色皿中，以Tris-HCl 缓冲溶液为参比溶液，测定BR-BSA 体系的紫外吸收光谱。

1.3 荧光光谱法

1.3.1 荧光光谱测定 溶液的配制方法同“1.2 项”，选择扫描方式为Emission，固定激发波长为280 nm，扫描范围为290 nm～500 nm，分别在293 K、305 K 和310 K 温度下测定BR-BSA 体系的荧光光谱。

1.3.2 同步荧光光谱 选择扫描方式为Synchronous，固定发射与激发波长的差值Δλ1=15 nm、Δλ2=60 nm，扫描范围为240 nm～400 nm，分别测定BRBSA 体系的同步荧光光谱。

2 结果与讨论

2.1 紫外光谱法

BR-BSA 体系的紫外光谱见图1。由图可知，随着BR 浓度的增大，体系在280 nm 附近的吸收峰强度逐渐增大，且最大吸收峰位置从279 nm 蓝移到275 nm。280 nm 处的吸收峰是由BSA 中的酪氨酸（Tyr）残基和色氨酸（Trp）残基引起的，280 nm附近吸收峰增强并发生轻微蓝移，表明BR 与BSA 之间发生了相互作用并且使BSA 的肽链结构发生了轻微改变，BSA 分子内部的Tyr 残基和Trp 残基的疏水基团暴露出来，由于疏水基团之间的疏水作用增强，导致吸收峰发生蓝移。

图1 BR-BSA 体系的紫外吸收光谱（T=293 K）

2.2 荧光光谱法

2.2.1 BR 对BSA 的荧光猝灭作用 荧光猝灭是指荧光物质与溶剂分子之间发生相互作用，从而使物质的荧光强度降低的现象。导致荧光物质发生荧光猝灭的原因包括生成新的络合物、分子间碰撞、重排和能量转移等［8］。

由于BSA 含有苯丙氨酸残基、酪氨酸残基和色氨酸残基使其具有内源性荧光，其中，Trp 残基荧光强度最大，而苯丙氨酸残基的量子产率较低，荧光强度可忽略不计［9］。因此本研究将Tyr 残基和Trp 残基作为研究对象，选择280 nm 作为激发波长，使Tyr 残基和Trp 残基的荧光同时被激发。保持BSA 的浓度不变，不断增加BR 溶液的浓度，BR-BAS 体系的荧光光谱见图2。由图可知，最大发射波长为350 nm。随着BR 浓度的增大，体系的荧光峰强度逐渐减弱，表明BR 对BSA 具有荧光猝灭作用。

图2 BR-BSA 体系的荧光光谱（T=293 K）

2.2.2 BR 对BSA 构象的影响 同步荧光光谱可进一步了解Tyr 残基和Trp 残基周围的微环境变化和疏水性的变化情况。Δλ=15 nm 的同步荧光光谱只表示酪氨酸残基的光谱特性，而Δλ=60 nm 的同步荧光光谱仅表现色氨酸残基的荧光光谱特性。BR-BSA 体系的同步荧光光谱见图3、图4，由图可知，当Δλ=15 nm 时，随着 BR 浓度的增大，体系的荧光峰强度逐渐减弱，且最大发射波长λmax发生了轻微的蓝移，λmax由289.4 nm 移至288.8 nm。当Δλ=60 nm 时，体系的荧光峰强度出现了下降，最大发射波长λmax未发生移动。本实验结果与高平章等［10］研究 BR 与 BSA 相互作用的实验结果一致，进一步证明BR 与BSA 相互作用过程中Tyr残基和Trp 残基所处微环境及微环境的疏水性改变很小，其肽链伸展程度变化甚微，即BR 的加入并没有使BSA 中的Tyr 残基和Trp 残基的构象发生明显变化。

图 3 BR-BSA 体系的同步荧光光谱（Δλ=15 nm，T=293 K）

图 4 BR-BSA 体系的同步荧光光谱（Δλ=60 nm，T=293 K）

2.2.3 猝灭类型的确定 根据荧光猝灭机制，荧光猝灭类型分为静态猝灭和动态猝灭，静态猝灭是指猝灭剂与荧光物质之间形成了弱荧光或不发荧光的复合物；动态猝灭是指猝灭剂与荧光物质的激发态分子之间相互碰撞而导致荧光强度降低。对于动态猝灭，随着温度的升高，分子的有效碰撞概率增大，电子转移加剧，荧光物质的猝灭常数随温度升高而增大；而对于静态猝灭而言，随温度的升高，复合物的稳定性会降低，猝灭常数减小。

假设BR 与BSA 属于动态猝灭，遵循Stem-Volmer 方程［11］：F0/F=1+Kqλ0[Q]=1+KSV[Q]，其中，F0和F 分别为加入BR 前后体系的荧光强度；[Q]为BR 的浓度，τ0为荧光物质的平均寿命，约为10-8s；Kq 是体系的猝灭速率常数，KSV为 Stern-Volmer猝灭常数。

根据 Stern-Volmer 方程，以（F0-F）/F 对[Q]作图，得不同温度下BR 对BSA 的Stern-Volmer 曲线（图5），计算得速率常数和相关系数（表1）。

图5 不同温度下BR-BSA 体系的Stern-Volmer 曲线

表1 不同温度下BR 和BSA 的线性方程及相关参数

由表1 可知，随着温度的升高，猝灭常数KSV的数值递增，KSV 与温度呈正相关则为动态态猝灭；但是各温度下的Kq 值均远大于最大动态猝灭速率常数2×1010L/（mol·s），证明BR 与BSA 作用的猝灭类型为静态-动态联合猝灭，其中静态猝灭起主导作用。

2.2.4 结合常数、结合位点数和作用力类型的确定 静态猝灭遵循Lineweaver-Bruk 双倒数方程［11］：lg［（F0-F）/F］=lgK+nlg［Q］，其中，F0和 F 分别为加入BR 前后体系的荧光强度；[Q] 为BR 的浓度，K为结合常数，n 为结合位点数。

根据 Lineweaver-Bruk 方程，以 lg［（F0-F）/F］对lg[Q]作图，通过斜率和截距计算得结合常数和结合位点数，结果见表2。

表2 不同温度下BR 与BSA 的表观结合常数K 及结合位点数

由表2 可知，BR 与BSA 两者结合位点数 n约为1，即BSA 上只有一个BR 的结合位点，结合常数K 随温度的升高不断减小，进一步证明BR与BSA 的作用过程中静态猝灭起主导作用。

根据药物与蛋白质反应的热力学参数的变化，可判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型。当ΔH>0，ΔS>0 时，表明 BR-BSA 之间为疏水作用力；当ΔH<0，ΔS>0 时，表明 BR-BSA 之间为静电引力；当ΔH<0，ΔS< 0 时，表明 BR-BSA 以范德华力或氢键作用力结合［12］。当温度变化不大时，反应的焓变△H 可视为常数，结合公式 ln（K2/K1）=ΔH/R×（1/T1-1/T2），求出焓变ΔH，由公式ΔG=-RTlnK 求出反应的自由能ΔG，再根据公式ΔG=ΔH-T△S，可求出熵变ΔS，见表 3。

表3 不同温度下BR-BSA 体系的热力学参数

由表 3 可知，ΔG<0，说明 BR 与 BSA 反应过程可自发进行。由于ΔH<0，说明该反应过程是放热过程，ΔH<0，ΔS>0，所以两者之间作用力主要为静电引力。

3 结 论

本实验采用紫光谱法、荧光光谱法对BR-BSA体系的相互作用机制、作用力类型进行了定性分析。研究结果表明，BR 对BSA 的荧光猝灭类型为静态-动态联合猝灭，其中静态猝灭起主导作用。在BSA 中逐步加入灯盏花素溶液后，BSA 的Tyr残基和Trp 残基所处的微环境没有发生显著改变，表明其内疏水性并没有改变，其肽链的伸展程度也未改变，所以可推断出BSA 中Tyr 残基和Trp 残基的构象在一定程度上没有发生变化。由热力学参数ΔH<0，ΔS>0，得出两者之间的作用力主要是静电引力，依据Lineweaver-Bruk 方程计算出结合位点数和不同温度下的结合常数，两者之间的结合距离有待进一步研究。