甜荞多糖提取工艺的优化及其颗粒剂的制备

张育贵，吴红伟，李东辉，张淑娟，辛二旦，牛江涛，司昕蕾，李越峰

（甘肃中医药大学，甘肃省中药质量与标准研究重点实验室，甘肃兰州730099）

荞麦是廖科荞麦属荞麦的种子，其栽培品有普通荞麦（甜荞）和鞑靼荞麦（苦荞）两种［1］。荞麦被认为是传统的保健佳品，富含高蛋白、多糖、黄酮、植物甾醇、肌脂等成分［2］，有开胃宽肠、下气消积的功效，用于治疗绞肠痧、肠胃积滞、慢性泄泻等，也可预防高血脂、高血糖、高血压等。荞麦多糖为主要的功能性成分，是国内外研究的热点；大量研究表明，荞麦多糖除具有抗氧化、抗肿瘤、清除自由基等药理作用外［3-5］，还能够为生物体提供能量，是构建细胞壁的主要成分，同时还具有保护生物体的功能［6］。本实验采用水提醇沉法优化甜荞多糖的最佳提取工艺，并制备其颗粒剂，为后续开发和利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

甜荞麦（Fagopyrum esculentum Moench.），来源于蓼科植物荞麦的干燥成熟种子。本研究所用的甜荞采自陕西定边，经甘肃中医药大学药学院中药鉴定教研室王明伟副教授鉴定为正品。

1.2 试剂与仪器

如表1、表2 所示。

1.3 方法与结果

1.3.1 标准溶液的制备 精密称取无水葡萄糖对照品0.010 0 g，置50.00 mL 容量瓶中，纯水溶解，超声，定容至刻度线，即得葡萄糖标准溶液。

表1 实验试剂及批号

表2 实验仪器及型号

1.3.2 最大吸收波长的确定 准确吸取葡萄糖标准溶液0.20 mL 于10.00 mL 的容量瓶中，加入5%苯酚溶液1.50 mL，浓硫酸7.50 mL，定容，60 ℃水浴加热20 min 后流水冷却，紫外分光光度计400～600 nm 范围内扫描，测得最大吸收波长为490 nm。

1.3.3 标准曲线绘制 依次准确吸取葡萄糖标准溶液 0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL 于 10 mL 容量瓶中，按“1.3.1”项下方法制备待测液，以0 mL 标准液管为空白对照，在490 nm 处测定吸光度。如图1，在浓度为0.002～0.014 mg/mL 时，吸光度与浓度呈良好的线性关系，回归方程 Y=66.601X-0.053 6（R2=0.998）。

图1 葡萄糖标准曲线

1.3.4 方法学考察

1.3.4.1 精密度实验 精密量取6 份质量浓度为0.01 mg/mL 的葡萄糖标准液 0.2 mL，按“1.3.2”方法连续测定吸光度值并计算，结果得RSD 为0.38%，表明仪器精密度良好。

1.3.4.2 重复性实验 精密量取质量浓度为0.01 mg/mL 的葡萄糖标准液 0.2 mL 6 份，按“1.3.2”方法分别测定吸光度值并计算，结果得RSD 为0.73%，表示该方法重复性良好。

1.3.4.3 稳定性实验 精密量取质量浓度为0.01 mg/mL 的葡萄糖标准液，分别放置 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h 各取 0.2 mL 按“1.3.2”方法测定吸光度值并计算，结果得RSD 为1.2%，表明样品稳定性较好。

1.3.4.4 加样回收率实验 精密量取6 份0.9 mg/mL 的定边甜荞多糖提取液0.1 mL，分别加入一定量葡萄糖对照品，测定吸光度值，计算回收率，如表3。平均回收率为98.13%，RSD 值为1.03%，表明该方法回收率良好。

表3 加样回收率实验结果 （n=6）

1.3.5 甜荞多糖提取工艺 定边甜荞粉末20 g（40 目筛）→80%乙醇回流→抽滤→取滤渣→水回流提取→4000 r/min 离心10 min→取上清液，浓缩至25 mL→3 倍量95%乙醇沉淀→静置24 h→4000 r/min 离心7 min→弃上清液→沉淀加水溶解→定容至250 mL 备用。

1.3.6 单因素试验 影响甜荞多糖提取工艺的主要因素为提取温度、提取时间、料液比，本试验对这3 个因素进行考察［7］，单因素试验方法设计如表4。

表4 单因素试验设计表

1.3.7 均匀设计试验［8］在单因素试验的基础上，以吸光度大小为指标，用U5（53）均匀设计试验确定提取时间、提取温度、料液比的最佳组合，从而优化甜荞多糖提取工艺。均匀设计的因素水平如表5。

1.3.8 荞麦多糖颗粒剂的制备及质量测定［9-10］

1.3.8.1 制备方法 将可溶性淀粉、糊精研磨成细粉，过50 目筛备用。精确称取含水量为18%的荞麦多糖6 g，按一定比例加可溶性淀粉和糊精共18 g 充分混匀，加70%乙醇制软材，经14 目筛制粒，60 ℃干燥3 h，整粒，筛除细粉，即得荞麦多糖颗粒，处方比例见表6。

表5 均匀设计因素水平表

表6 处方比例

1.3.8.2 颗粒剂主要质量指标的测定方法 ①溶解性测定：精密称定表中各处方颗粒0.5 g 加入干燥至恒重的15 mL 离心管中，精密加入沸水10 mL，搅拌振荡5 min，4000 r/min 离心10 min，弃去上清液，在80 ℃将残渣烘干至恒重，精密称定，计算溶化率［溶化率（%）=溶化颗粒质量/总颗粒质量×100%］。以溶化率100%为25 分，依此类推计算得分。②成型性测定：取各处方样品20 g，分别依次通过1 号筛与4 号筛，以合格颗粒（能通过1 号筛但不能通过4 号筛的颗粒）的质量与样品质量的比为成型率。以成型率100%为25 分，以此类推计算得分。③吸湿性测定［11］：称取各处方颗粒约2 g，精密称重，放入已恒重的称量瓶中，置于相对湿度75%（氯化钠饱和溶液密闭24 h 可获得）条件下，24 h 后取出，精密称定扁形称量瓶与样品的质量，测定吸水量，计算吸湿率［吸湿率=（吸湿后颗粒质量-吸湿前颗粒质量）/吸湿前颗粒质量×100%］。以吸湿率0%为50 分，对各处方进行扣分，计算各处方分值。

2 结 果

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 提取时间对荞麦多糖含量的影响 料液比为1∶15、提取温度为80 ℃的条件下，考察不同提取时间 1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h 对荞麦多糖含量的影响。结果见图2。

图2 提取时间对荞麦多糖含量的影响

由图2 可知，随着提取时间的不断增加，荞麦多糖的提取效果呈升高的趋势，在3 h 时提取效果最好，从2.5 h 至3 h 之间变化幅度不大，增加趋势较为平缓，故选取3 h 为最佳提取时间。

2.1.2 提取温度对荞麦多糖含量的影响 料液比为1∶15、提取时间3 h 的条件下，考察不同提取温度 60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃对荞麦多糖含量的影响。结果见图3。

图3 提取温度对荞麦多糖含量的影响

由图3 可知，随着提取温度不断升高，荞麦多糖的提取率呈不断增大的变化趋势，在90 ℃提取效果最好，从80 ℃到90 ℃变化趋势变小，若再增加温度，提取率变化不大，故选取90 ℃为最佳提取温度。

2.1.3 料液比对荞麦多糖提取效果的影响 提取时间3 h、提取温度为90 ℃的条件下，考察不同料液比 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 对荞麦多糖含量的影响。结果见图4。

图4 料液比对荞麦多糖含量的影响

由图4 可知，随着料液比不断增加，荞麦多糖的提取率呈不断增大的趋势，料液比为1∶20 时提取效果最好，故选取1∶20 为最佳提取料液比。

2.2 甜荞多糖含量提取均匀试验

在预试验基础上，以提取时间（X1）、提取温度（X2）、料液比（X3）为考察因素，以定边甜荞多糖含量（Y，多糖含量＝供试品溶液中多糖质量浓度×供试品溶液总体积/药材质量）为评价指标，选用均匀设计表U5（53）设计试验方案。称取定边甜荞粉末5 份，每份20.00 g，按“1.3.1”项下方法处理，测定样品中多糖含量。

按U5（53）表安排的试验方案测定甜荞多糖含量，每个试验重复3 次，试验结果见表7。

表7 均匀试验结果 （n=3）

利用SPSS 19.0 软件对试验数据进行二次多项式回归分析处理，可得到Y 与料液比（X1）、提取时间（X2）、提取温度（X3）的回归方程为：

Y=0.016 37-0.424 9X1+0.048 2X2+0.067 0X3（R2=0.992 5，F=44.092 7>F0.25（3，1）=8.20）

通过检验，回归方程有意义。利用单因素轮换法求回归方程的极大值（最优值），其结果如下：料液比为1∶10，提取时间为2 h，提取温度为80 ℃。按优化条件再次进行试验，其结果为12.27 mg/g，与预测值基本相符，表明优化条件可信。

2.3 多糖颗粒剂的制备

2.3.1 溶解性测定 结果见表8。

表8 溶解性测定结果

2.3.2 成型性测定 结果见表9。

表9 成型性测定结果

2.3.3 吸湿性测定 结果见表10。

表10 吸湿性测定结果

2.3.4 综合评价 结果见表11。

表11 颗粒剂处方综合评价表

以多糖部位浸膏为原料，采用可溶性淀粉和糊精作为辅料，荞麦多糖部位与可溶性淀粉和糊精比例为2∶1∶5，并使用70% 乙醇作为润湿剂进行颗粒剂的制备，所得颗粒剂成型性、流动性好且不易粘连，溶化速度快且静置后无沉淀。

3 讨 论

本试验最后得到的甜荞多糖最佳提取工艺为10 倍量水在80 ℃下提取120 min，该条件下提取多糖含量实测值为12.27 mg/g；优化得到的最佳制粒工艺荞麦多糖、可溶性淀粉和糊精用量比例为2∶1∶5，并使用70%乙醇作为润湿剂制得颗粒剂成型性、流动性好且不易粘连，溶化速度快且静置后无沉淀。

本研究探讨水提醇沉法对定边甜荞多糖的提取条件及影响因素，确定最佳提取工艺。但是荞麦多糖属于复合性多糖，其具体结构尚不清楚，而在多数测定多糖的试验当中以葡萄糖为标准品测量结果只能作为参考，因此，在后期的开发研究中可以向研究荞麦多糖的结构及测量多糖含量方向发展。

荞麦多糖具有增强免疫、抗氧化、肝损伤保护、中枢抑制、铅中毒保护等作用［12-14］。谷仿丽等［15］发现荞麦多糖能使模型小鼠脾脏系数、吞噬指数、半数溶血值、胸腺系数及足趾厚度差等指标显著提高，表明其具有较好的免疫增强作用。同时有研究表明，苦荞多糖对超氧阴离子、羟基自由基有明显的抑制作用［16］。张季等［17］研究发现，苦荞麦多糖可显著降低铅中毒小鼠组织和血浆中的铅含量，并显著提高铅中毒小鼠组织和血浆中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力，降低丙二醛（MDA）含量，表明苦荞麦多糖可通过提高抗氧化酶活性和清除自由基，从而改善铅中毒造成的损伤。基于此，荞麦多糖具有较高的开发价值，同时本研究发现陕西定边拥有大量的甜荞资源，利用最优的条件提取多糖并开发出颗粒剂作为新的保健食品及医药产品对于今后利用其预防和治疗人类疾病具有积极的研究价值。