补肾健脾活血方对大鼠悬尾试验性骨质疏松和肌萎缩影响的实验研究

杨先文 ，杨香红 ，胡 海 ，黄宏兴

（1.广州中医药大学第三附属医院，广东广州510360； 2.中国人民武装警察部队广东省总队医院，广东广州510507；3.北京卫戍区丰台第三离职干部休养所，北京100000； 4.中国人民解放军南部战区空军医院，广东广州510000）

废用性骨质疏松症又称失用性骨质疏松症，是指由于骨骼的机械张力刺激减少所引起的全身或局部骨量丢失［1］。失重骨质疏松症属于废用性骨质疏松症的一种，是指由于重力消失所导致的骨量减少，肌肉退化而易于发生骨折的一种全身性骨骼肌肉系统性疾病，属于中医学“骨痿”的范畴［1］。报道发现航空员1 个月在太空上丢失的骨量相当于地球表面绝经后妇女 1 年的骨量丢失［2］。Vico L 等［3］发现30 d 的飞行可以导致胫骨松质骨骨量减少1.7%；飞行6 个月后，胫骨皮质骨骨量减少了1.8%，松质骨骨量减少了5.4%。长期失重还导致肌肉流失，宇航员飞行22 d 后，比目鱼肌的流失量可达到30%以上［4］。肌肉的流失导致了肌肉力量下降，飞行人员每次执行任务肌肉最大收缩力可按6%～25%速度衰减。动物研究发现，大鼠4～7 d 的航天飞行，其比目鱼肌就可发生约37%的萎缩，而尽管采取了一系列措施，但6 个月的航天飞行仍会使抗重力性骨骼肌发生大约20%的萎缩［5］。

广州中医药大学第三附属医院在对骨质疏松症和肌萎缩的长期临床治疗和研究过程中，对其治疗以补肾壮骨、健脾益气配合活血化瘀为法，精心筛选提炼药物组方补肾健脾活血方，用于骨质疏松症治疗10 年余，已获得国家发明专利［6］。前期研究表明，该方能把握治疗骨质疏松症的根本环节，是目前防治骨质疏松症的理想中药制剂，在改善骨密度和雌二醇水平方面明显优于阿仑磷酸钠，有效地延缓骨质疏松的进展［7］。细胞和动物实验也表明该方可促进成骨细胞的形成，对成骨细胞增殖分化具有直接促进作用，利于成骨［8］。此外，补肾健脾活血方可在一定程度上调控骨质疏松骨骼肌通透性转化孔（Mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的开放程度，具有防止骨质疏松骨骼肌萎缩的潜在功效［9］，但补肾健脾活血方是否可以防治废用性骨质疏松暂无研究。本研究通对建立模拟失重雄性大鼠骨质疏松模型，建模成功之后分别给予高、低剂量补肾健脾活血方干预，观察对照组和干预组大鼠的血生化指标、骨密度改变情况，为今后该方治疗失重性骨质疏松的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SD 大鼠由广州中医药大学实验动物中心提供（合格证号0017012）。所有SD 大鼠均喂养在恒温、恒湿的清洁环境中，环境温度为（25±1）℃，湿度为 70%，每天 12 h 光照／黑暗，任意进食，饲养大鼠标准饲料和自来水。大鼠以标准化的饲料和水进行随意饲养，在进行悬尾实验前经历1 周的适应期。大鼠置于大小为25 cm×45 cm×30 cm 饲养小笼，单笼喂养。动物实验由广州中医药大学动物伦理委员会审批合格，编号20180134。

1.1.2 实验药物 补肾健脾活血法拟方，药物组成：补骨脂、白芍各10 g，制淫羊藿、肉苁蓉、熟地黄、黄芪、菟丝子、丹参各12 g，当归 8 g，大枣 6 g。该方采用复方水提醇沉工艺提取药物，使之含生药量1.43 g/mL，供灌胃用，由广州中医药大学第三附属医院制剂室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠饲养和悬尾实验

48 只SD 大鼠随机分为补肾健脾活血方高剂量组、低剂量组、模型组和空白对照组，每组12只。除空白对照组外，其余各组均选用大鼠悬尾实验制备废用性骨质疏松和肌萎缩模型［10］。尾吊前所有大鼠用温肥皂水清洗鼠尾，去除油脂和皮屑，剃刀去除尾毛；实验开始时用安息香配和松香涂于鼠尾，以防粘贴物对皮肤的激惹作用。喷涂松香还可使尾部皮肤表面变涩，增加胶带的黏性。将适宜长度和宽度的纯棉质医用透气胶带（透气性好、刺激性小、黏性强）对折，粘贴于尾吊组鼠尾两侧距尾根部 1 cm 远，鼠尾近2/3 长度范围、皮肤较厚的部位，鼠尾上、下面留有2 mm 的间隙未粘贴胶带以免压迫皮下鼠尾动、静脉，影响鼠尾部正常血循环。保持大鼠头低位，身体纵轴倾斜与水平呈30°，使大鼠的后爪在伸直时刚好不能触及笼的底层，即处于悬空不负重状态，前肢着地可自由活动、觅食饮水。造模共计28 d，造模期间，补肾健脾活血方高剂量组给予补肾健脾活血方提取物2.50 g/（kg·d）灌胃，补肾健脾活血方低剂量组给予补肾健脾活血方提取物1.25 g/（kg·d）灌胃，造模组和空白对照组给予等剂量饮用水灌胃，每天1 次。28 d 后，全部大鼠腹腔采血后处死，取右侧股骨以及L1～4椎骨和完整分离左右侧比目鱼肌。

1.3 指标检测

1.3.1 酶联免疫吸附法（ELISA）检测成骨标记物在第28 天处死大鼠前，采用双抗夹心ELISA 检测大鼠成骨标记物血清骨形成蛋白2（BMP-2）、骨钙素（OCN）及破骨标记物抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）水平（R&D system，MN，美国），分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔。操作按大鼠趋化因子试剂盒说明进行，每孔各加入稀释PBS 缓冲液稀释 1000 倍的待测血清 10 μL，37 ℃ 温育 30 min；洗液洗板 5 次，加入酶标试剂 50 μL，混匀，37 ℃温育30 min，洗板后加入显色剂避光显色10 min。在450 nm 波长下测量各孔的吸光度值（OD 值）。根据标准品的浓度及对应的OD 值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD 值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

1.3.2 Real-time PCR 检测成骨相关基因的表达应用 Real-time PCR 对 OCN、Runx-2 两成骨相关基因进行定量分析并进行比较。股骨组织总RNA 的提取及逆转录从样本保存液中取出，根据RNA 提取试剂盒上的操作步骤进行（TAKARA，日本）。RT-PCR 反应GAPDH 作为内标基因，设计OCN、Runx-2 等引物的序列。反应条件均为：95 ℃ 3 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，循环 40 次。每标本检测2 次。根据最终的优化体系，比较目的基因与内标基因的扩增效率的斜率回归有无统计学意义。如果无统计学意义，应用比较阈值法即2-△△Ct，所得结果表示目的基因相对于空白对照组的倍数，如果有统计学意义，按Rasmussen 计算出相对表达差异，每次实验均重复3 次。

1.3.3 双能X 线骨密度测定 在第28 天试验结束时取各组大鼠右侧股骨以及L1～4椎骨，除净附着其上的肌肉和软组织，生理盐水冲洗，用双能X射线骨密度分析仪测定大鼠离体椎骨以及右侧股骨的骨密度，骨密度值以单位面积的骨矿物质含量（g/cm2）表示，并进行统计学分析。

1.3.4 比目鱼肌湿重比与横截面积测量 取出比目鱼肌称量其湿重，所得数据以100 g 体质量标化，对各组动物的每一比目鱼肌组织各随机抽取2 张接近肌腹中部的切片，每张切片在200 倍光镜随机观察3 个视野。肌纤维横截面积的观察则取不少于20 个肌细胞，将其总面积除以肌细胞个数，得出各种不同类型的肌纤维横截面积的平均值。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 大鼠一般情况观察

实验过程中各组大鼠一般情况变化，健脾活血方高剂量组因麻醉过量致死1 只；健脾活血方低剂量组死亡2 只，造模组死亡2 只，空白对照组死亡2 只。死亡原因均为灌胃不当误入肺部或肠胃胀气致死。最后纳入统计分析的各组大鼠的数量为：健脾活血方高剂量组11 只、健脾活血方低剂量组10 只、模型组10 只、空白对照组10 只。

2.2 补肾健牌活血方对股骨和椎体骨密度的影响

与空白对照组相比，模型组大鼠右侧股骨和椎体 BMD 显著降低（P＜0.05），说明我们建立废用性骨质疏松模型成功。与模型组相比，健脾活血方高剂量组大鼠右侧股骨和椎体BMD 显著增高（P＜0.05），健脾活血方低剂量组右侧股骨和椎体BMD 虽然有增高趋势，但差异无统计学意义。结果见图 1、图2。

图1 补肾健脾活血方对悬尾大鼠股骨BMD 的影响

图2 补肾健脾活血方对悬尾大鼠椎体BMD 的影响

2.3 补肾健牌活血方对血清成骨标记物BMP-2和破骨标记物TRAP 的影响

与空白对照组相比，模型组大鼠血清BMP-2显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，健脾活血方高剂量组BMP-2 呈显著性增高，健脾活血方低剂量组血清 BMP-2 有升高趋势，但差异无统计学意义。与空白对照组相比，模型组大鼠血清破骨标记物TRAP 显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，健脾活血方高剂量和低剂量组血清TRAP 显著降低（P＜0.01，P＜0.05）。结果见图 3、图 4。

图3 补肾健脾活血方对悬尾大鼠血清成骨标记物BMP-2 的影响

图4 补肾健脾活血方对悬尾大鼠破骨标记物TRAP 的影响

2.4 补肾健牌活血方对股骨组织成骨因子OCN和Runx-2 mRNA 的影响

与空白对照组相比，模型组大鼠股骨OCN 和Runx-2 mRNA 的表达显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，健脾活血方高剂量组和低剂量组大鼠股骨 OCN 和 Runx-2 mRNA 表达显著增高（P＜0.05）。结果见图5、图6。

2.5 补肾健牌活血方对比目鱼肌湿重比与横截面积的影响

图5 补肾健脾活血方对悬尾大鼠股骨OCN mRNA 的影响

图6 补肾健脾活血方对悬尾大鼠股骨Runx-2 mRNA 的影响

与空白对照组相比，模型组大鼠左侧和右侧比目鱼肌平均湿重显著降低（P＜0.01），说明废用性骨质疏松模型可以引起肌萎缩。与模型组相比，健脾活血方高剂量和低剂量组左侧和右侧比目鱼肌平均湿重显著增高（P＜0.05）。与空白对照组相比，模型组大鼠左侧和右侧比目鱼肌I 型和II 型纤维横截面积显著降低（P＜0.01，P＜0.05），健脾活血方高剂量组左侧和右侧比目鱼肌平均湿重比较差异无统计学意义；与模型组相比，健脾活血方高剂量组左侧和右侧比目鱼肌I 型和II 型纤维横截面积显著增高（P＜0.05），健脾活血方低剂量组左侧和右侧比目鱼肌I 型纤维横截面积现模型组比较显著增高（P＜0.05），但II 型纤维横截面积与模型组比较差异无统计学意义。结果见图 7、图 8。

图7 补肾健脾活血方对悬尾大鼠比目鱼肌平均湿重比的影响

3 讨 论

本研究探讨了补肾健脾活血方对悬尾大鼠失重致骨质疏松和肌萎缩的影响，发现高低剂量补肾健脾活血方均可在一定程度上改善悬尾引起的骨质疏松和肌萎缩，表明补肾健脾活血方对于废用性骨质疏松和肌萎缩均有防治作用，临床上可用于辅助治疗。

图8 补肾健脾活血方对悬尾大鼠比目鱼肌I 型和II 型纤维平均横截面积的影响

本研究选用大鼠悬尾实验建立废用性骨质疏松和肌萎缩模型。由于空间飞行机会宝贵，实验条件和研究的系统性都受到限制，因此地面模拟实验已成为研究空间骨丢失的主要方式。悬尾实验是将啮齿类动物尾巴固定，然后倒悬动物的身体，来观察动物的行为活动，其最初常应用于绝望情绪实验研究中［10］。在悬尾实验中，实验鼠非常厌恶被拉着尾巴倒吊在空中，因此处于悬尾状态的实验鼠会努力挣扎。但是当其因无法寻找到脱离困境的方法而绝望后，将会放弃挣扎而静止于悬持状态，此时实验鼠身体核心处于失重状态。

近年来发现采用大鼠悬尾试验可在地面上模拟太空的失重状态，且一直被研究者采用至今［11-12］。在航天器所能提供的资源极其有限的前提下，这种失重的模拟方法被认为是一种行之有效的方法。研究表明尾悬吊大鼠后股骨远端和胫骨近端骨密度均明显下降，且股骨力量明显降低［13-14］。不仅如此，模拟失重状态下比目鱼肌的萎缩，尾悬吊14、30 d 后比目鱼肌的相对湿重分别下降了11%和19%［15］。此外研究人员用放射性微球标记后肢卸载大鼠，其股骨和胫骨的血流量明显减少，这种血流的减少与减负后肢的骨质减少量高度相关，提示骨血流灌注的改变可能会干扰骨吸收和骨形成的平衡［16］。说明大鼠尾悬吊模型可以成功诱导承重骨骨质疏松、相应的肌萎缩以及微循环障碍。

本研究发现补肾健脾活血方可以显著提高尾悬吊大鼠股骨和椎体骨密度以及股骨成骨标记物OCN 和Runx-2 的表达，提高血清成骨标记物BMP-2 表达，降低血清破骨因子TRAP 的表达。此外补肾健脾活血方还可以提高比目鱼肌湿重比与I 型和II 型纤维横截面积，表明补肾健脾活血方可用于废用性骨质疏松。