特定激活性吞噬受体的配体与广谱肿瘤抗原的化学生物学桥接

张国秀,郑晨晨,赵智辉

(南京师范大学生命科学学院,生物化学与生物制品研究所,江苏省分子与医学生物技术重点实验室,江苏 南京 210023)

2018年GLOBOCAN数据统计表明全球乳腺癌(Breast Cancer,BC)和结直肠癌(ColoRectal Cancer,CRC)的发病率及死亡率都位居前列[1]. 三大传统疗法治愈率低且存在严重毒副作用,免疫治疗越来越受到重视,成为肿瘤治疗史上的重大突破[2]. 在免疫治疗中,肿瘤疫苗具有耐受性好、低毒性和易于注射等优点而受到专门研究,但存在疫苗免疫原性低、肿瘤异质性、肿瘤免疫逃避及抑制性肿瘤微环境等问题[3-5],使其尚未表现出显著的临床益处,这就亟需探索更有效的肿瘤疫苗制备方法.

目前,制备肿瘤疫苗的方法主要有以下几种:反复冻融法获取的肿瘤细胞全蛋白作为肿瘤疫苗;合成已经明确的肿瘤抗原肽作为肿瘤疫苗;特定肿瘤抗原肽与特定激活性受体结合(如HER2与Fc的融合蛋白)[6]制备肿瘤疫苗;深度测序法鉴定肿瘤特异性新抗原(Tumor Specific neo-Antigen,TSnA)后进行抗原合成[7]制备肿瘤疫苗;将肿瘤抗原基因导入适当的细胞内,以表达该基因的肿瘤细胞作为肿瘤疫苗使用;以及负载肿瘤抗原的树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)[8]作为肿瘤疫苗等等. 根据以上方法制备的肿瘤疫苗形式多样,包括肽疫苗、DNA或RNA疫苗、DC疫苗和全细胞疫苗等,但是每种疫苗应用时存在一定的弊端,比如肽疫苗需要合适的免疫佐剂,且具有HLA限制;DNA/RNA疫苗有毒副作用、裸露的DNA或者质粒效果微弱、较难发现合适的载体;DC疫苗的制备成本高且DCs的分离、扩增、刺激成熟等过程仍具有技术挑战[9];全细胞疫苗可能会引发自身免疫,并且难以监测未知TAA产生的免疫应答. 这些方法在临床试验中未能展现出良好的治疗效果,可能的根本原因之一是尚无法做到将广谱肿瘤抗原通过特定激活性吞噬受体途径递送给APCs.

目前,真正能诱发机体产生抗肿瘤免疫应答的是TSnA,而TSnA的鉴定非常耗时耗财. 因此,经济快捷地制备覆盖尽可能多TSnA的广谱肿瘤抗原,并使其通过激活性内吞受体递送从而激活免疫系统是一个可行的策略.

本研究利用糖代谢掺入[10]和生物正交反应[11],将肿瘤细胞表面唾液酸化肿瘤抗原与特定激活性吞噬受体的配体进行桥接,尝试制备一种能够有效激活机体体液免疫和细胞免疫的肿瘤疫苗.

1 材料与方法

1.1 主要试剂

四乙酰叠氮甘露糖胺(Tetraacetylated N-Azidoacetyl-D-Mannosainem,Ac4ManNAz)、Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne、Click-iT DIBO-biotin和ProLong® Gold Antifade Reagent购自Thermo Fisher公司;唾液酸(N-Acetylneuraminic acid)购自Sigma公司;Anti-biotin,HRP-linked Antibody购自CST公司;IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Biotin购自Jackson ImmunoResearch公司;BCA蛋白定量试剂盒、Protein G Beads和Protein G 磁珠购自Bioworld公司;无酶细胞消化液、D-PBS购自Gibco公司;蛋白酶抑制剂混合物购自Bimike公司;蛋白分子量标准购自Thermo公司;多聚甲醛购自上海凌峰化学试剂有限公司;无水乙醇购自广东光华科技股份有限公司;RIPA Lysis Buffer、苯甲基磺酰氟(PMSF)由本实验室配制.

细胞培养所使用的青霉素、链霉素、0.25%胰蛋白酶和RPMI 1640培养基购自WISENT公司;胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)购自康源公司.

1.2 主要仪器

D-37520台式离心机、BB5060UV细胞培养箱、HEAL FORCE生物安全柜、ELx 808酶标仪、SS-325高压蒸汽灭菌锅、DC1010恒温水浴锅、IX51倒置荧光显微镜、PB-20酸度计、SIM-F124雪花状制冰机、PowerPac 200/HC/3000电泳仪、Guava EasyCyte Mini System流式细胞仪等.

1.3 细胞与细胞培养

小鼠4T1乳腺癌细胞和CT26.WT结直肠癌细胞(购自中国科学院细胞库)在37 ℃、5% CO2的条件下,用含10% FBS和抗生素(100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)的RMPI 1640完全培养液培养.

1.4 流式细胞术

收集对数生长期的4T1和CT26.WT细胞,计数,铺2×104细胞于96孔板培养24 h,共14孔. 吸去 7个孔上清后,不同浓度Ac4ManNAz培液(0、0.1、0.25、0.5、1、2、3)mmol/L继续共培养24 h. 弃剩余7个孔上清,3 mmol/L Ac4ManNAz培液继续培养细胞指定时间(0、4、8、12、16、20、24)h. 用含1% FBS的 D-PBS 洗3次. 无酶消化液收集细胞,与含1% FBS、50 μmol/L Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne的D-PBS混合,轻轻吹打混匀,室温、避光孵育60 min. 用含1% FBS 的D-PBS洗4次. 用含4%多聚甲醛的D-PBS固定细胞 15 min. 用D-PBS洗细胞3次. 用0.5mL D-PBS重悬细胞. 流式细胞仪检测.

1.5 免疫荧光技术

收集对数生长期的4T1和CT26.WT细胞,计数,2×104细胞分别与2 mmol/L Ac4ManNAz和2 mmol/L Sia培液混匀,加入腔室培养室(各2个复孔),培养24 h. 用含1% FBS 的D-PBS洗3次. 50 μmol/L Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne的D-PBS与细胞混合,室温、避光孵育60 min. 用3% BSA的D-PBS洗3次. 用4%多聚甲醛固定细胞15 min,0.25% Triton® X-100的D-PBS打孔细胞,室温15 min. 用含1% BSA的 D-PBS 洗3次. 室温下干片(至无明显液体),将培养玻片与腔体分离. 在培养细胞处滴加ProLong® Gold Antifade Reagent 1滴,使其覆盖载玻片上的细胞;加盖清洁的盖玻片(片下不能有气泡),室温下水平搁置、避光干燥24 h,使封片剂固化. 荧光显微镜观察、采集图像.

1.6 生物正交反应

2 mmol/L Ac4ManNAz培液于10 cm皿中培养4T1和CT26.WT细胞24 h. 用1×PBS清洗细胞2次. 1 mL冷RIPA裂解液(裂解液∶蛋白酶抑制剂∶PMSF=100∶1∶1)裂解细胞,晃动培养皿使裂解液覆盖整个皿底,放置冰上30 min,每隔10 min晃动一次. 刮下细胞,将细胞裂解液吸至1.5 mL EP管. 4 ℃,12 500 rpm,离心10 min. 转移上清至1.5 mL EP管,99 ℃加热6 min,置于冰上10 min. 加入150 μL 2 mmol/L DIBO-Biotin 充分混匀,室温孵育2 h. 孵育结束后,取适量样品进行BCA蛋白定量和Western Blot分析.

1.7 冰乙醇沉淀蛋白

取100 μL 生物素化蛋白溶液于1.5 mL EP管,沿管壁分次、缓慢加入1 mL冰乙醇(v/v=1/10),边加边涡旋,-80 ℃静置过夜.

1.8 免疫沉淀

取-80 ℃醇沉生物素化蛋白,4 ℃,12 500 rpm,离心10 min. 弃上清,用1 mL冰乙醇清洗蛋白沉淀 2次. 将EP管置于冰上,待残留乙醇挥发干净. 用50 μL～100 μL PBS溶解蛋白沉淀. 完全溶解后,取适量样品进行BCA蛋白定量. 根据蛋白定量结果,取含200 μg生物素化蛋白溶液于1.5 mL EP管,加入10 μL 1.3 μg/μL anti-Biotin抗体,涡旋混匀. 4 ℃震荡孵育过夜.

取100 μL Protein G Beads于0.5 mL EP管. 4 ℃,300 rpm,离心1 min. 弃上清,用500 μL 1×PBS清洗Protein G Bead 3次,每次需静置5 min. Protein G Beads与上述抗原抗体孵育物充分混合,4 ℃震荡孵育过夜. 4 ℃,300 rpm,离心1 min. 转移上清至0.5 mL EP管. 用200 μL 1×PBS清洗Protein G Beads 3次,保留洗液. 用50 μL 1×Loading buffer重悬Protein G Beads,99 ℃,煮样5 min. 4 ℃,12 500 rpm,离心1 min. 分别取上清、洗液和Protein G Beads样品进行Western Blot分析.

1.9 生物素化抗原与anti-Biotin抗体最佳结合比例

4管200 μg醇沉生物素化蛋白(4T1和CT26.WT细胞)与不同量anti-Biotin抗体(1、2.5、5、10)μg混匀,4 ℃孵育过夜. 取200 μL磁珠G于0.5 mL EP管,4 ℃,4000 rpm,离心3 min. 弃上清,用500 μL 1×PBS清洗磁珠G 3次,每次需静置5 min. 用200 μL 1×PBS重悬磁珠G,将其平分为4管,50 μL/管. 4 ℃,4 000 rpm,离心3 min. 弃上清,磁珠G与上述抗原抗体孵育物混匀,室温孵育2 h. 4 ℃,4000 rpm,离心3 min,转移上清至EP管. 用200 μL 1×PBS清洗磁珠G 3次,保留洗液. 用50 μL 1×Loading buffer重悬磁珠G,99 ℃,煮样5 min. 4 ℃,12 500 rpm,1 min. 分别取上清、洗液和磁珠G样品进行Western Blot分析.

1.10 肿瘤疫苗的制备

细胞传代时用0.5 mmol/L Ac4ManNAz培液培养4T1和CT26.WT细胞24 h后,2 mmol/L Ac4ManNAz培液再培养细胞24 h. 收集细胞进行裂解获得蛋白裂解液,加热变性后进行生物正交反应. 用冰乙醇沉淀法除去蛋白溶液中未反应的生物素. 用适量PBS复溶生物素化蛋白,并与适量anti-Biotin抗体混合,4 ℃震荡孵育过夜.

1.11 统计学分析

实验数据采用均值±标准差(Means±SD)表示,用One-way ANOVA或t检验来分析数据间的差异显著性,图由 GraphPad5.0 软件完成. 实验重复3次以上,P<0.05,则具有统计学显著差异.

2 结果与讨论

2.1 Ac4ManNAz代谢掺入到细胞的最佳掺入参数

流式细胞分析Ac4ManNAz代谢掺入条件参数,结果如图1所示. 从图A和C可以看出,随着Ac4ManNAz浓度的增加,4T1和CT26.WT细胞的平均荧光强度逐渐增强,两者成正相关. 从图B和D可以看出,3 mmol/L Ac4ManNAz培养细胞不同时间,随着培养时间的延长,4T1和CT26.WT细胞的平均荧光强度先增加后降低再增加,呈折线形变化,且相邻培养浓度(时间)间具有显著性差异(**P<0.01,***P<0.001). 通过对总荧强度的分析,选择Ac4ManNAz最佳掺入浓度是2 mmol/L,最佳培养时间是24 h.

2.2 Ac4ManNAz通过糖代谢掺入到细胞

用免疫荧光技术直观考察Ac4ManNAz代谢掺入情况,结果如图2所示(A代表4T1细胞、B代表CT26.WT细胞),两种细胞的Ac4ManNAz实验组有荧光且非常强烈,而Sia对照组没有荧光. 这表明Ac4ManNAz能通过细胞糖代谢途径掺入到4T1和CT26.WT细胞表面含唾液酸的糖蛋白中,使糖蛋白带上叠氮基团.

2.3 Biotin-DIBO使叠氮化蛋白生物素化

收集Ac4ManNAz和Sia代谢掺入的肿瘤细胞蛋白溶液,变性后与Biotin-DIBO进行生物正交反应,Western blot检测叠氮化蛋白的生物素化情况,结果如图3所示. 从图A和B可以看出,Ac4ManNAz实验组有目的条带,且比Sia对照组条带明显,说明Biotin-DIBO能高效地使叠氮修饰的糖蛋白生物素化.

2.4 生物素化蛋白与anti-Biotin抗体交联成免疫复合物

醇沉生物素化蛋白与anti-Biotin抗体混匀,4 ℃震荡孵育过夜,Protein G Beads富集交联复合物进行Western blot分析,结果如图4所示. Protein G Beads样品有生物素化蛋白条带,而上清、一洗和二洗样品中几乎没有目的条带,从而证明生物素化蛋白能与anti-Biotin抗体交联成免疫复合物,且是高效的.

2.5 生物素化蛋白与anti-Biotin抗体的最佳结合比例

100 μg醇沉生物素化蛋白与不同量的anti-Biotin抗体混合,4 ℃震荡孵育过夜后,磁珠G负载交联复合物进行Western blot分析,结果如图5所示(A代表4T1细胞、B代表CT26.WT细胞). 从图A和图B可以看出,随着anti-Biotin抗体量的增加,交联复合物的量也增加,两者成正相关;但对于CT26.WT细胞,当抗体量为2.5 μg和5 μg时,交联复合物条带几乎一致,说明2.5 μg anti-Biotin抗体几乎已达到饱和. 综合考虑,4T1细胞的抗原抗体最佳孵育比例是20∶1,而CT26.WT细胞的孵育比例是25∶1.

2.6 肿瘤疫苗制备的检测

蛋白免疫印迹及免疫沉淀技术对制备疫苗的各步骤进行检测,确保叠氮糖的代谢掺入、生物正交反应以及抗原抗体反应等步骤的有序进行,保证疫苗组成成分的均一性及疫苗的有效性,结果如图6所示(A代表4T1细胞、B代表CT26.WT细胞). 从图A和B可以看出,用于免疫的肿瘤抗原都高度均一地进行了生物素化标记,并能与Anti-Biotin抗体高效地交联成免疫复合物.

3 结论

肿瘤是世界范围内导致死亡的常见疾病,诸如乳腺癌、结直肠癌等难治性肿瘤,三大传统疗法尚且无法显著改善患者存活率,因此,治疗重心转向肿瘤免疫治疗. 在过去的几十年里,肿瘤疫苗一直被专门研究,并在肿瘤治疗方面取得卓越成就. 迄今为止,用于治疗BC和CRC的肿瘤疫苗虽能诱发机体产生免疫应答,但是应答持续时间短且强度弱. 目前,还未有FDA批准的用于治疗BC的疫苗[12],也没有一种治疗CRC的肿瘤疫苗在大型III期试验中显示出临床益处[13-14].

本研究结果显示,利用化学生物学方法,可将4T1和CT26.WT细胞广谱肿瘤抗原与IgG1亚型Anti-Biotin抗体桥接成免疫复合物(疫苗),使广谱抗原通过特定激活性吞噬受体(Fc Recetor,FcR)途径递送给APCs. 这种疫苗制备方法简单、快速且经济. 理论上,叠氮化修饰封闭了肿瘤抗原上的唾液酸位点,避免了唾液酸化抗原介导的免疫耐受[15];多种抗原通过FcR被APCs摄取后,能通过下游激活性信号基序诱发机体产生激活性抗肿瘤免疫应答,而非抑制性抗肿瘤免疫应答[16-17],但是缺乏动物实验对疫苗的有效性进行验证. 因此,在后续研究中,拟进行细胞学实验和动物实验以评估疫苗的免疫效果. 在细胞水平上,分离、培养小鼠骨髓DCs,检测肿瘤抗原对DCs 表面分子及细胞因子表达的影响,包括MHCⅠ、MHCⅡ、CD45、CD80、CD86、IFN-γ、IL12等;在动物水平上,以BALB/c小鼠为材料,建立预防性和治疗性小鼠异位移植瘤模型,检测小鼠肿瘤生长速率、存活率、外周血中不同类型淋巴细胞的数量如CD8+T、CD4+T、调节性T细胞和特异性抗体. 在建立动物模型时采用鼠源性细胞系而非个性化人源肿瘤细胞,因此,在验证鼠源肿瘤细胞抗原疫苗的有效性后,还需采用人源肿瘤细胞抗原对小鼠进行免疫以评估其有效性,且人源肿瘤细胞对人的抗原效果仍存在相应的不确定性. 此外,免疫佐剂的选择、免疫剂量和时序等问题也有待研究[18].

总之,本研究利用化学生物学方法将特定激活性吞噬受体的配体与广谱肿瘤抗原桥接成免疫复合物,这只是实现相应目标的第一步,后续还需通过动物实验来评估疫苗的疗效,但也为临床上乳腺癌、结直肠癌乃至其他癌症的治疗提供了借鉴和参考,为肿瘤免疫治疗提供了新的方法和新的研究理论.