C-myc、LSD1、β-catenin蛋白在套细胞淋巴瘤中的表达及临床意义

邹宗楷 林燕玲 沈洪武 翁剑鸣 纪思灵

套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）占非霍奇金氏恶性淋巴瘤的6%左右，主要发生于老年男性，常规化学治疗效果差。MCL典型免疫表型通常为Cyclin D1阳性。显著的分子生物学改变是t（11；14）（q13；q32）易位导致高表达Cyclin D1，研究显示MCL的发生还有很多分子遗传学因素的参与[1]。C-myc癌基因位于8q24区，是一种转录因子，主要通过基因易位、重组扩增方式活化，在细胞增殖、分化及凋亡方面有重要的生物学功能。恶性淋巴瘤中，C-myc在非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin lymphoma，NHL）细胞中存在不同程度的高转录水平，与预后不良有关。组蛋白甲基化或去甲基化是一种重要的可逆性的表观遗传修饰方式，参与调控基因结构改变和功能表达。去甲基化酶分为两个家族：LSD1和含有JmjC结构域的蛋白质。LSD1在多种肿瘤组织中高表达，干扰LSD1能抑制肿瘤细胞增殖。β-catenin是经典Wnt信号转导通路致癌的关键，在细胞黏附和增生过程中均有重要作用。MCL细胞中存在Wnt信号通路β-catenin蛋白异常定位和高表达，其转移入细胞核后与Tcf/Lef结合，通过组蛋白甲基化启动了包括C-myc等在内的Wnt信号通路靶基因转录激活[2]。本文采用免疫组化检测MCL组织中C-myc与LSD1、β-catenin蛋白表达，并分析三者之间的相关性以及与临床病理特征的相关性，为进一步探讨三种蛋白异常表达在MCL发生发展中的可能分子机制以及运用siRNA技术进行C-myc基因敲除和功能研究提供初步理论基础。

1 材料与方法

1.1 临床材料

收集福建医科大学附属漳州市医院2010年1月—2015年12月收治的30例MCL。其中男性21例、女性9例，年龄51～78岁；结内24例、结外6例，经典型25例、母细胞型4例、多形性型1例；临床分期：Ⅰ期6例、Ⅱ期9例、Ⅲ期7例、Ⅳ期8例。以30例淋巴结良性病变作为对照组。

1.2 主要试剂与仪器

兔抗人C-myc多克隆抗体、鼠抗人β-catenin单克隆抗体购自福州迈新公司、兔抗人LSD1多克隆抗体购自美国Novus公司。SP试剂盒为福州迈新公司产品。美国罗氏BenchMark全自动免疫组织化学染色仪。

1.3 方法

制作30例MCL和30例淋巴结反应性增生的石蜡病理组织切片，按SP试剂盒说明书行免疫组化染色，以PBS代替一抗作为空白对照，用阳性对照片作为阳性对照。

1.4 判断标准

采用半定量积分法：根据着色强度和着色细胞所占百分比综合判断。（1）按着色强度计分：无着色为0分，轻度为1分，中度为2分，强着色为3分；（2）按着色百分比计分：无阳性细胞为0分，阳性细胞数＜25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。将两项得分结果相加：0分为（﹣），1～2分为（﹢），3～4分为（﹢﹢），5～7分为（﹢﹢﹢）。（﹢﹢﹢）者为阳性高表达。C-myc无阳性细胞为0分，阳性细胞数<10%为1分，10%～30%为2分，＞30%为3分。病理医师双盲法进行评估。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。秩和检验、卡方检验和Spearman相关性分析比较C-myc与LSD1、β-catenin在MCL中表达差异，与Costwolds临床分期的关系，分析三种蛋白表达之间相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 C-myc与LSD1、β-catenin在MCL中的表达

C-myc与LSD1的阳性产物主要定位在细胞核。β-catenin阳性产物主要定位在细胞质/膜。C-myc在MCL中的阳性高表达率为30%（9/30）（图1），在对照组阳性高表达率为10%（3/30）（图2），两组相比差异有显著性（P<0.05），LSD1、β-catenin在MCL组的阳性高表达率分别为53.33%（16/30）（图3）和80%（24/30）（图5），明显高于淋巴结反应性增生组中的表达13.33%（4/30）（图4）和16.66%（5/30）（图6），P值均＜0.01）。见表1。

2.2 C-myc与LSD1、β-catenin蛋白表达与MCL临床病理特征的相关性

C-myc的表达与病变部位（P=0.072）、病理组织类型（P=0.082）、临床分期（P=0.091）均无相关性；LSD1表达与病变部位（P=0.068）、病理组织类型（P=0.078）、临床分期（P=0.084）均无相关性；β-catenin的表达与病变部位（P=0.075）、病理组织类型（P=0.081）、临床分期（P=0.093）无相关性。

表1 C-myc、LSD1、β-catenin在MCL中的表达

表2 MCL组织中LSD1、β-catenin与C-myc表达的相关性

2.3 MCL组织中C-myc、LSD1、β-catenin表达的相关性

C-myc与LSD1表达呈正相关（r=0.47），C-myc与β-catenin表达存在正相关发展趋势（r=0.42），LSD1和β-catenin表达呈正相关（r=0.54）。P值均小于0.05。见表2。

3 讨论

近年来，联合化疗及利妥昔单抗等生物靶向治疗使套细胞淋巴瘤患者的治疗效果显著提高，但仍有部分患者复发耐药并最终死亡。MCL病因及发病机制仍不清楚，多个因子异常表达、多个信号通路异常激活与其发生发展有关。

1982年Collins首次在白血病细胞中发现C-myc癌基因扩增现象，它定位于8q24区，是一种转录因子，主要通过基因易位、重组扩增方式活化，在细胞增殖及凋亡方面有重要的生物学功能[3]。恶性淋巴瘤中，C-myc在DLBCL细胞存在不同程度的高转录水平，与预后不良有关[4]。C-myc在发病率较低的MCL中重排发生率及其预后意义研究尚少，2014年北协和邱录贵[5]使用FISH方法检测患者C-myc/8q24，发现C-myc扩增或获得具有独立预后不良因素的统计学意义。

LSD1是一个蛋白质赖氨酸脱甲基酶，2004年Shi Y等研究发现在FAD的参与下，LSD1可以使细胞内组蛋白H3K4和H3K9去甲基化，影响细胞生化代谢及增殖凋亡[6]。LSD1可特异性去除p53第370位赖氨酸甲基，抑制p53活性，促进凋亡相关蛋白Bcl-2、Procaspase3及C-myc表达。课题组前期实验发现[7-8]：MCL患者肿瘤组织中LSD1蛋白呈高表达状态，采用RNAi技术下调套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞LSD1基因，凋亡相关蛋白Bcl-2、Procaspase3及C-myc表达量减少。

β-catenin在细胞质/膜累积是经典Wnt信号转导通路致肿瘤的关键正性调节因子。基因表达谱分析检测到MCL细胞中存在Wnt信号通路β-catenin蛋白异常定位和高表达，其转移入细胞核后与Tcf/Lef结合，通过组蛋白甲基化启动了包括C-myc等在内的Wnt信号通路靶基因转录激活。

图1 C-myc在MCL高表达，SP法；图2 C-myc在反应性淋巴结炎低表达，SP法；图3 LSD1在MCL高表达，SP法；图4 LSD1在反应性淋巴结炎低表达，SP法；图5 β-catenin在MCL高表达，SP法；图6 β-catenin在反应性淋巴结炎低表达，SP法

宋爱琴等[9]应用RNAi技术，经慢病毒载体介导的siRNA转染Jiyoye细胞，可沉默C-myc基因，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，揭示沉默C-myc基因在白血病和淋巴瘤靶向治疗中的作用。尽管RNAi已广泛用于肿瘤免疫基因治疗方面的研究，但较少RNAi技术沉默C-myc基因治疗MCL的文献研究。

本研究选用30例临床及病理确诊的MCL行免疫组织化学分析发现：患者肿瘤组织中蛋白C-myc、LSD1、β-catenin呈高表达状态，与对照组相比差异具有显著性，且C-myc与LSD1、β-catenin蛋白表达呈正相关及正相关发展趋势（rs=0.47和rs=0.42），LSD1与β-catenin呈正相关（rs=0.54），P值均小于0.05，提示三种蛋白高表达在MCL发生及发展中起一定的促进作用，与有关文献报道一致[10]。

综上所述，本实验从临床MCL患者病理组织的蛋白水平研究提示C-myc可能通过LSD1和β-catenin调控组蛋白甲基化和Wnt信号通路，但蛋白表达是否与基因异常符合还有待于分子水平进一步研究。小干扰RNA技术广泛应用，C-myc有望与LSD1、HDAC[11-12]一样成为人类多种肿瘤靶向药物研发的新目标，并可能成为精准治疗MCL的新方法。