改良Videman法复制兔膝骨关节炎的实验研究

刘 晶 林巧璇 卢莉铭 郭泽兴 刘 洪 张良志 修忠标

1福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004；2福建中医药大学中医学院，福建 福州350122；3中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建 福州350122；4福建省骨伤研究所，福建 福州350004* 通信作者：修忠标，E-mail：xzbdoctor@sina.com

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是指由多种因素引起的以进行性软骨损害、软骨下骨硬化、滑膜炎症为表现的最常见慢性骨关节病，临床以关节疼痛、肿大、僵硬伴关节功能障碍等为主［1］。KOA患病率高，全球约有2.5亿人患有KOA，中国KOA患病率为8.1%［2］。目前，随着全球人口老龄化进程加快，KOA发病率也呈上升趋势，已成为全球第四大致残性疾病［3］。由于KOA发病机制尚未完全清楚，该病的临床症状经久难愈，反复发作。积极探索其发病机制，从而开发新治疗技术和治疗方法，对提高KOA的临床疗效具有重要作用。因此，制作稳定的、符合疾病发展规律的KOA理想动物模型是保证机制研究成功开展的关键环节。KOA模型制作最常用的动物为新西兰大白兔，造模方法主要分为力学失衡法及化学药物刺激法［4-6］。其中经典的Videman造模法通过伸直位固定建立膝KOA模型［7］，模拟了KOA发病过程中的软组织慢性劳损，不受手术创伤及炎症的影响，是开展实验研究的相对理想模型［8］。然而，既往研究已表明Videman造模法在实践过程中存在造模时石膏固定不牢靠、下肢缺血坏死发生率高，造模结束后石膏不易拆卸等不足［9-10］。本团队在采用Videman造模法建立KOA兔模型用于针刀干预机制研究中，也发现了同样的问题。基于此，本团队开展改良Videman造模法建立KOA模型制作的研究，通过行为学、影像学、软骨形态学特征进行模型评价，并比较2种造模方法的石膏固定、石膏拆卸平均耗时及造模成功率，为建立稳定、可靠、有效的KOA兔模型提供科学方法和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

普通级健康雄性6月龄新西兰白兔60只，体质量（2.0±0.5）kg，订购于上海松联实验动物责任有限公司［生产许可证号码：SCXK（沪）2017-0008］，委托福建省中医药研究院实验动物中心［SYXK（闽）2016-0005］饲养。实验动物单笼喂养，饲养房温度20～25℃，湿度30%～60%，自然光照，自由进食、饮水。适应性饲养1周后，按随机数字表法随机分为正常组、传统Videman法组（简称传统组）和改良Videman法组（简称改良组），每组20只。本实验已通过福建省中医药研究院动物实验伦理委员会批准（FJATCM-IAEC2019037），实验过程对动物的处置遵循科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。

1.2 主要试剂与仪器

HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；水合氯醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；4%多聚甲醛、10%EDTA、0.9%NaCl注射液（南京丁贝生物有限公司）；光学显微镜、自动脱水机、组织包埋机、Leica2025石蜡切片（德国Leica公司）；黏附载玻片、盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司）；手术刀片（上海医疗器械批发部有限公司）；一次性包埋盒、包埋模具（上海源叶生物技术有限公司）；高分子石膏（陕西安信医学技术开发有限公司）；普通石膏（浦江健宇卫生材料有限公司）；数显关节角度尺（上海三量工具有限公司）；DR机（日本岛津公司）；3.0T磁共振（德国西门子公司）。

1.3 造模方法

传统组将兔左后肢膝关节用高分子石膏管型固定于伸直位［7］。改良组在传统Videman造模法的基本原理上进行改良。具体方法：①将兔子仰卧于固定架上，助手面朝兔尾端坐下；先用2层脱脂棉包绕膝关节；然后右手握住实验兔左后肢踝关节并牵拉，使膝关节处于伸直中立位0°位置；再用左手将石膏托（采用普通石膏制作，长约8 cm，宽约6 cm，厚度6～8层，提前塑型备用）放置在膝前侧，石膏托的上1／4中心位于髌骨中点。② 操作者立于助手的右侧，用高分子石膏绷带单层螺旋缠绕大腿根部到趾尖上2 cm，然后塑型，保持膝关节伸直中立位0°，踝关节背曲60°。③ 最后使用防啃咬绷带环形缠绕高分子石膏表面，防止兔啃咬石膏。见图1。

1.4 指标检测及方法

1.4.1 动物一般情况观察 造模6周期间，定期观察造模期间兔一般状况，记录兔石膏脱落、左后肢血运、会阴部感染及饮食等情况。

1.4.2 石膏固定、石膏拆卸平均耗时 记录传统组与改良组石膏固定操作时间、石膏拆卸时间，计算平均完成1只兔石膏固定及拆卸所需时间并进行比较。

1.4.3 Lequesne MG膝关节级别评分 造模结束后1 d，采用 Lequesne MG 评分［11］评估造模前后膝关节功能，包括疼痛刺激反应（0～3分）、步态改变（0～3分）、关节活动（0～3分）、关节肿胀（0～2分）。Lequesne MG膝关节评分总分反映膝关节功能障碍程度，总分越高，膝关节功能障碍影响越大。

1.4.4 影像学观察 造模结束后1 d，采用腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL／kg）麻醉实验兔行左膝关节X线、MRI检测。X线检测方法：拍正位片取仰卧位，屈髋 30°，伸膝 0°，髋外展 15°，保持髌骨位于正前方，放射球管距离膝关节110 mm；拍侧位片取患侧卧位，患侧（左后肢）肢体伸直，健侧（右后肢）肢体屈髋70°，屈膝45°，放射球管距离膝关节110 mm；检测参数设置为照射电压50 kV、照射电流250 mA、照射量32 mAs、照射时间128 ms。MRI检测方法：取仰卧位，膝关节处于外翻位，固定角度为15°，扫描仪中心定位于髌骨下极处。扫描序列及参数包括：① T1-tse-cor（FOV：100 mm×100 mm，ST：2 mm，TR：831 ms，TE：11 ms）；② PD-tse-fs-tra（FOV：100mm×100 mm，ST：3 mm，TR：4 930 ms，TE：20 ms）；③ T2-tse-sag（FOV：100 mm×100 mm，ST：2 mm，TR：6 860 ms，TE：84 ms）；④ T2-de3d（FOV：130 mm×130 mm，ST：0.6 mm，TR：19 ms，TE：9 ms）。 观察造模前后左膝关节间隙、关节腔积液、软骨面光滑度等变化，磁共振膝关节骨关节炎的分级参考MOAKS评分［12］，包括① 关节软骨缺损：0分为无，1分为＜10%，2分为10%～75%，3分为＞75%；② 滑膜炎：0分为正常，1分为轻度，2分为中度，3分为重度；③ 关节积液：0分为生理量，1分为少量，2分为中量，3分为大量；④ 骨赘：0分为无，1分为轻，2分为中，3分为重；⑤ 其他关节周征象，包括鹅足滑囊炎、髌下囊信号异常、髌前囊信号异常，1分为有，0分为无。MOAKS评分总分反映KOA损伤程度，总分越高，KOA程度越重。

1.4.5 形态学观察 于造模结束后 1 d，麻醉下耳缘静脉空气栓塞处死，将实验兔放置于冰面上，迅速解剖左侧膝关节。行髌前正中切口，逐层分离软组织至关节囊，用尖刀切断股四头肌在髌骨上缘附着处的肌腱，血管钳提起髌骨上缘，沿髌骨两侧向下分离至胫骨平台，切断前后交叉韧带侧副韧带，暴露股骨髁软骨面和髌前滑膜，肉眼观察关节软骨、滑膜表面的形态、厚度以及色泽等大体的变化。软骨肉眼观评分参照PELLETIER等［13］的研究：关节软骨表面光滑呈淡蓝色或无色半透明状，计0分；关节软骨表面软化但平滑，计1分；关节软骨变薄，出现小纤维束状变，计2分；关节软骨明显纤维束状变，计3分；关节软骨呈磨损性纤维束状变，伴软骨下骨外露及骨硬化，计4分。评分越高说明软骨退变越严重。然后清除股骨远端周边肌肉及韧带，用咬骨钳取下股骨远端。生理盐水清洗、滤纸吸干后投入4%多聚甲醛中固定48 h。固定后用流水冲洗标本4 h，用10%EDTA对软骨进行常规脱钙处理。脱钙完全后修切并进行常规石蜡包埋，以厚度5 μm进行组织石蜡切片制备，将组织切片置于60℃烘箱中干燥30 min后，放入二甲苯中脱蜡10 min；然后梯度乙醇溶液中入水各3 min；沥干后浸入苏木精液中染色10～20 min，蒸馏水冲洗；1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗20 min至水清澈；PBS返蓝，蒸馏水冲洗；入伊红染料复染1 s，使细胞质染成红色，中性树胶封片，待封片剂凝固后拍照，图像采集分析。每张片选择3个视野，参照Mankin’s评分［14］进行分数统计。分级标准：正常0～2分，轻度病变3～7分，中度病变8～11分，重度病变12～14分。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料服从正态分布以（±s）表示，2组间比较采用t检验，3组间采用单因素方差分析，方差齐用LSD-t检验，方差不齐用Tamhane’s T2检验；非正态分布采用秩和检验，计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组兔造模期间一般情况比较

见表1。

表1 3组兔造模期间一般情况比较Table 1 Comparison of general situation in three groups of rabbits during modeling

2.2 3组兔左膝关节Lequesne MG评分比较

见表2。

表2 3组兔左膝关节Lequesne MG评分比较（±s） 分Table 2 Comparison of Lequesne MG scores of left knee joint in three groups （±s）Scores

表2 3组兔左膝关节Lequesne MG评分比较（±s） 分Table 2 Comparison of Lequesne MG scores of left knee joint in three groups （±s）Scores

注：与正常组比较，1） P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05.

L e q u e s n e M G评分0 7.5 0 0±1.3 1 4 1）7.5 5 6±1.1 4 9 1）组别正常组传统组改良组n 2 0 1 2 1 8

2.3 3组X线和MRI影像学比较

见图2和图3。

图2结果提示，造模结束后1天，与正常组相比，改良组与传统组关节间隙均变窄（P＜0.05）；图3结果提示，关节腔内积液增多、股骨髁软骨面欠光滑，MOAKS评分显著升高（P＜0.05）。改良组与传统组影像学结果比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 3组左膝关节X线检测关节间隙比较Figure 2 Comparison of X-ray images of left knee joint space in three groups of rabbits

2.4 3组组织形态学比较

见图4和图5。

图4结果提示，与正常组相比，改良组与传统组软骨面无光泽，关节面变粗糙，部分有缺损，髌前滑膜增厚，色泽发黄，软骨肉眼观评分均升高（P＜0.05）。图5结果提示，软骨表层不平整，软骨细胞排列欠规整，偶见软骨细胞簇集，Mankin’s评分均升高（P＜0.05）。改良组与传统组的形态学比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 石膏固定时间和拆卸时间比较

见表3。

3 讨 论

理想的KOA动物模型能够有效地模拟疾病发展过程。目前常用的KOA建模方法包括关节腔内注射药物法，如注射木瓜蛋白造模法［5］；外科手术法，如 Hulth 法［6］；关节制动法，如 Videman 法［7］。其中Videman造模法制作的KOA模型无关节内影响和手术创伤，更接近病情自然发展过程。研究表明Videman造模法固定6周是制作KOA模型的理想方法［15-16］。但是实践中发现，传统Videman造模法易造成兔下肢缺血性坏死、石膏脱落、拆卸困难等不足，其他学者也遇到类似问题［9-10］。

图3 3组兔左膝关节MRI检测MOAKS评分比较Figure 3 Comparison of MRI images and MOAKS scores of left knee joint in three groups of rabbits

图4 3组兔软骨及滑膜肉眼观评分比较Figure 4 Comparison of the macropathology scores of cartilage and synovium in three groups of rabbits

为解决上述问题，改良Videman造模法参考传统Videman造模法的基本原理进行改良，具有以下3个特点。①膝前放置石膏托，有效防止石膏脱落：因为兔髌骨底离髋关节仅3～4 cm，只要管型石膏上缘脱离髌骨底上 1 cm左右，兔膝关节就可以弯曲活动，影响造模效果。传统Videman造模法从髋部向下打石膏，用踝关节的弯曲角度（保持踝关节背曲60°）以阻止管型石膏滑落，但实际造模过程中石膏常常向下脱落导致造模失败。分析原因考虑为兔因左后肢固定导致兔不适感而反复甩动导致脱落；另外在长期制动过程中，因为兔肌肉萎缩也可出现石膏脱落。而改良Videman造模法通过在膝前放置石膏托，起到良好固定作用，只要保证石膏托不滑离膝关节，就可以保证膝关节伸直位。②使用高分子石膏，减少下肢缺血坏死率：传统Videman造模法使用普通石膏，成型较慢，塑型时间较久，需要叠加至一定厚度才具有固定效果，且其透气性差，影响血液循环［9］。并且传统Videman造模法为了防止石膏脱落，会加压缠绕，尤其在踝关节处加压，容易导致下肢缺血性坏死［10］。改良Videman造模法使用有机高分子石膏，成型快，塑型时间短，厚度薄且硬度高，耐磨损，只需要薄薄一层高分子石膏带环形缠绕塑型即可确保石膏托不滑动，缠绕中也不需要加压，从而降低下肢缺血坏死发生率。③石膏拆卸容易：传统Videman造模法的管型石膏需要专门的切割工具进行拆卸，难度较大，耗时长，且容易损伤兔皮肤。改良Videman造模法仅薄薄一层高分子石膏，仅用普通钳子即可完成拆卸，方便拆卸并大大缩短拆卸时间。

图5 3组兔股骨髁软骨HE染色光镜观察Mankin’s评分比较（×100）Figure 5 Comparison of Mankin's scores and HE staining observed by light microscope of femoral condyle cartilage in three groups of rabbits （×100）

表3 2组石膏固定及拆卸时间比较（±s）Table 3 Comparison of fixation and disassembly time of gypsum between two groups （±s）min

表3 2组石膏固定及拆卸时间比较（±s）Table 3 Comparison of fixation and disassembly time of gypsum between two groups （±s）min

注：与传统组比较，1） P＜0.05。Note:Compared with the traditional group,1)P＜0.05.

石膏固定1 3.5 0 0±1.3 8 1 4.8 3 3±1.1 5 0组别传统组改良组n 1 2 1 8石膏拆卸3 0.8 3 3±1.8 5 0 2.9 4 4±1.1 6 2 1）

本实验结果表明：改良Videman造模法对比传统Videman造模法，具有简单舒适、拆装便利、固定牢靠和造模成功率高的优点，同时能够保证与传统Videman造模法一致的造模质量，可作为研究KOA机制的理想造模方法。然而改良组也会出现了石膏滑落、会阴部感染死亡和下肢肿胀坏死脱落等情况。为了提高造模成功率，总结分析了改良Videman造模法过程中的经验和教训，以下几点需要注意：①石膏托制作长度 6～8 cm，宽度5～6 cm，厚度 6～8层为宜，放置在以膝关节髌骨为中心，髌上2 cm到髌下6 cm位置。通过测量，髌底到髂前上棘的距离为3～4 cm，髌尖到踝关节中心的距离为9～10 cm，因此石膏托长度最长可达12～14 cm。但过长导致整体质量太大，限制兔髋部的活动，影响兔排尿，容易发生会阴部感染；过短容易滑落，需重打石膏，费时费力。因此本研究采取长度6～8 cm，取得良好的效果。石膏托需要保证与大腿皮肤一定的接触面积才能稳定，测量兔子大腿平均周径为10～12 cm，而太宽加重石膏质量，太窄容易滑动。本次研究采取石膏托宽度为大腿平均周径的1／2，取得很好的效果。石膏托需要一定的硬度才能够起到良好的支撑作用，太厚增加石膏重量，太薄石膏容易折断。本次研究表明石膏托厚度在6～8层即具有良好的硬度，且不会过重影响兔髋部活动。石膏托宜放置在以膝关节髌骨为中心，髌上2cm到髌下6 cm位置，石膏托上缘太靠近髋关节，会影响髋部的活动，太靠近髌骨，容易出现滑落。本次实验过程中改良组就出现1只兔因石膏托上缘太靠近髋关节，限制兔髋部的活动，影响兔排尿而发生会阴部感染。②缠绕高分子石膏切勿加压，尤其是在石膏托下缘处。初期打石膏特别追求石膏的牢靠，刻意在缠绕高分子石膏条时加压，尤其是担心石膏托向下滑动，故在石膏托下缘处加压缠绕，这样极容易造成下肢缺血性坏死。本次实验过程中改良组就出现1只兔因石膏托下缘缠绕高分子石膏条时过紧，影响下肢血液循环而出现下肢肿胀坏死。③高分子石膏条仅需缠绕1层即可。因为缠绕1层石膏条即可固定牢靠，不仅节约石膏费用，还透气轻便，拆卸方便。

本实验从兔左膝关节行为学、影像学、形态学角度揭示改良Videman造模法能够达到与传统Videman造模法一致的造模效果，通过对比固定与拆卸石膏操作耗时情况、造模过程中动物的死亡率，验证了改良Videman造模法操作简单、成功率高、死亡率低的优势，为KOA机制研究奠定基础。