MS-275对原代培养的胶质瘤细胞及其干细胞生物学行为和耐药性的影响

孟 亮 陈谦学 余小祥 涂 勤 王跃飞 樊 文 罗才奎

胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤，复发率高、病死率高，平均生存时间只有15个月左右[1～3]。肿瘤细胞依据其表面标记蛋白和分化特性，可以分为两种：第一种为已经分化成熟的肿瘤细胞；第二种具备自我更新和分化为其他细胞的能力，即肿瘤干细胞[4，5]。组 蛋 白 去 乙 酰 化 酶（histone deacetylases，HDAC）通过组蛋白的去乙酰化（去除乙酰基），使DNA更紧密地缠绕在组蛋白上，从而导致这些DNA不易被基因转录因子接触，结果导致与细胞分化、细胞周期阻滞、肿瘤免疫、受损细胞凋亡等有关的蛋白的表达受到抑制。HDAC抑制剂能选择性地恢复这些癌症抑制因子和其它抗癌基因的表达，还可以间接地抑制血管生成因子的表达，帮助阻断对肿瘤的血液供应[6]；因此，以HDAC 为肿瘤治疗靶点获得了越来越多的关注。而肿瘤细胞的细胞周期、细胞增殖和凋亡等行为，和肿瘤的发生、发展密切相关。诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖是药物执行抗肿瘤效应的主要作用方式之一。本文探讨HDAC抑制剂MS-275 对原代培养的人胶质瘤细胞（glioma cell，GC）及胶质瘤干细胞（glioma stem cell，GSC）生物学行为的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 GSC的分离和鉴定 取术中切除的脑胶质瘤瘤体深部无囊性变、无坏死肿瘤组织标本，修剪去除外周坏死组织，无血清培养基冲洗三遍，将组织块无菌剪成1 cm3大小，经0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA 消化15～20 min，用吸管反复吹打，沉淀后吸取上清，70 μm 孔径筛网过滤，除去红细胞，以2×105个活细胞/ml终浓度接种于培养瓶中继续培养。从取材到接种在30 min内完成。原代培养7 d，待培养基中悬浮的单克隆细胞团形状规则、体积较大后，弃去瓶底贴壁细胞，吸取培养基并离心后弃去半量陈旧培基，重新吹打成单细胞悬液，并应用MiniMACS免疫磁珠分选CD113阳性GSC，采用无血清的干细胞培养液（含碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、白血病抑制因子各20 ng/ml的DMEM/F12）培养。

取对数生长期细胞，胰酶消化成单细胞悬液，调整密度为1×106个/ml。取100 μl单细胞悬液，加入2 μl CD133-APC（eBioscience，17-1339-42）或2 μl Nestin-APC（eBioscience，MA5-23650），4 ℃避光孵育45 min。加入400 μl 流式染色缓冲液重现细胞，避光进行流式细胞仪（杭州艾森，NovoCyte）检测。

将细胞分为4 组：GC 组，GSC 组，GC+MS-275组，GSC+MS-275组；其中，GC组和GSC组不给予药物处理；GC+MS-275 组和GSC+MS-275 组给予8 mmol/L的MS-275处理24 h。

1.2 HDAC 的检测 收集对数生长期细胞，预冷0.01 mol/L PBS（pH 7.2）漂洗2 次，按照Nuclear/Cytosol Fractionation Kit（BioVision，K266-100）说明提取核蛋白，并分别按照Colorimetric HDAC Activity Assay Kit（BioVision，K332）说明操作，最后得到405 nm 波长处的A值。实验重复3次。

1.3 MTT法检测细胞增殖活性 取对数生长期细胞，以4×103/ml 接种于96 孔板，每组6 复孔，每孔加入20 μl MTT（5 g/L）溶液，37 ℃孵育4 h，小心弃去上清液，每孔加入150 μl 二甲基亚砜，微量振荡器震荡10 min，使结晶物充分溶解，酶标仪检测490 nm波长处光密度（optic density，OD）值。

1.4 流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡 取对数生长期细胞，制成单细胞悬液，按每孔1.0×104个细胞，将细胞均匀的接种到6孔板中培养24 h。用不含EDTA 的0.25%胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，1 000转/min 离心5 min，去上清，PBS 重悬2次；1 000转/min离心5 min，去上清，100 μl PBS重悬细胞，缓慢加入700 μl 预冷的80%乙醇，使乙醇终浓度为70%4℃固定4 h 以上，1 000 转/min 离心5 min，预冷PBS润洗2次，加入100 μl RNase（50 μg/ml），37 ℃水浴30 min加入400 μl PI（50 μg/ml），4 ℃避光染色30 min流式细胞仪检测。

1.5 免疫印迹法检测耐药相关蛋白表达 冰面上RIPA蛋白裂解液裂解细胞，每5 min振荡1次，裂解20 min，4 ℃条件下1 5000转/min离心30 min，吸取上清液获取总蛋白。根据BCA 蛋白定量结果上样，10%SDS-PAGE 凝胶电泳2.5 h，转膜后NC 膜TBS 稍荡洗，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入ABCG2、MPR1、MPR 4、Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K一抗4 ℃孵育过夜，TBST 洗10 min×3 次，室温孵育二抗1 h，TBST 洗10 min，重复3 次，曝光显影。采用BIO-RAD Image Lab 软件进行灰度值分析。

1.6 统计学方法 应用SPSS 22.0软件进行分析；定量资料以±s 表示；采用单因素方差分析；P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GSC 鉴定结果GSC 呈现出Nestin 和CD133 阳性。见图1。

2.2 MS-275 降低GC 和GSC 的HDAC 水平 与GC 组相比，GC+MS-275 组细胞HDAC 含量显著降低（P＜0.05）；与GSC组比较，GSC+MS-275组细胞HDAC含量显著降低（P＜0.05）。GSC+MS-275 组细胞HDAC含量显著高于GC+MS-275组（P＜0.05）。见图2。

2.3 MS-275 抑 制GC 和GSC 的增殖 与GC 组相比，GC+MS-275 组细胞增殖能力显著降低（P＜0.05）；与GSC 组比较，GSC+MS-275 组细胞增殖能力显著降低（P＜0.05）。GSC+MS-275 组细胞增殖能力显著高于GC+MS-275组（P＜0.05）。见图3。

2.4 MS-275 阻滞细胞周期及促进细胞凋亡 与GC组相比，GC+MS-275 组G0/G1期细胞比例明显增高（P＜0.05），细胞凋亡率显著增高（P＜0.05）；和GSC组比较，GSC+MS-275 组G0/G1期细胞比例明显增高（P＜0.05），细胞凋亡率显著增高（P＜0.05）。GSC+MS-275组G0/G1期细胞比例明显低于GC+MS-275组（P＜0.05），细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）。见图4。

2.5 MS-275对GC 和GSC 耐药性的影响 与GC 组相比，GC+MS-275 组细胞MPR4、ABCG2、MPR1、Bax、p-PI3K 表达水平显著升高（P＜0.05），而Bcl2 表达水平显著降低（P＜0.05）。与GSC组比较，GSC+MS-275组细胞MPR4、ABCG2、MPR1、Bax、p-PI3K表达水平显著升高（P＜0.05），而Bcl2 表达水平显著降低（P＜0.05）。GSC+MS-275 组细胞ABCG2、MPR1、Bax、p-PI3K 表达水平显著高于GC+MS-275 组（P＜0.05）。见图5。

3 讨论

胶质瘤是中枢神经系统中最常见的肿瘤之一，发病率占脑肿瘤的70%以上，具有恶性程度高和病死率高的特点[6，7]。化疗主要是消除成熟的肿瘤细胞，虽然能使肿瘤细胞数量减少、恶性肿瘤的体积缩小，但肿瘤干细胞却对化疗药物耐药。另外，所有肿瘤细胞在放疗过程中，在放射线照射下造成的DNA损害是相似的，但肿瘤干细胞具有更强的DNA修复功能，这导致放疗也不能干预肿瘤干细胞的增殖过程[8，9]。临床上使用的药物虽然可使瘤体缩小，但是，这些效果通常是暂时的，也不能明显地延长病人的生命；因为既使治疗方案可以令瘤体在表面上完全消失，但肿瘤干细胞也会继续增殖分化，促使肿瘤复发[10，11]。因此，只有当治疗方法直接针对肿瘤干细胞时，才可能阻止肿瘤的转移，并彻底治愈肿瘤。

肿瘤治疗失败的原因之一是肿瘤细胞逐渐产生了耐药性；另一个原因可能是现有的治疗方法不能有效地杀灭增殖速度较快的肿瘤干细胞。HDAC是组蛋白重要的表观遗传学修饰方式。MS-275 作为一种HDAC抑制剂，具有干扰去乙酰化酶功能，可通过有效上调抑癌基因的表达、阻断肿瘤生长和诱导肿瘤细胞选择性凋亡，达到治疗肿瘤的目的[12]。和普通抑癌药物比较，MS-275 具有靶向性好等特点，具有更强的特异性和选择性，而且其对癌细胞的耐药性有更突出的影响。Kristensen 等[13]发现当乳腺正常导管上皮发展为导管原位癌时，组蛋白乙酰化水平显著降低，因此认为组蛋白乙酰化可能在乳腺肿瘤进展中具有重要作用。本文结果显示MS-275显著降低原代培养胶质瘤细胞和GSCs 中HDAC 水平，提示MS-275对HDAC具有显著抑制作用；另外，MS-275促使胶质瘤细胞阻滞在G0/G1期，并促进其凋亡，GSCs虽然具有一定的抵抗作用，但是GSCs凋亡率仍明显降低。这提示MS-275 能阻断胶质瘤细胞的增殖，促进其凋亡；尽管GSCs对MS-275有一定耐药性，但其凋亡率仍然显著降低。

PI3K/Akt 信号通路对于细胞增殖、分化和凋亡的调节是必要的，是促进细胞存活、增殖、抗凋亡、促血管生成、化疗耐受的重要途径。多种肿瘤细胞PI3K/Akt信号通路异常，如卵巢癌[14]、乳腺癌[14]、恶性胶质瘤[15]、子宫内膜癌[16]、成神经管细胞瘤[17]、骨髓增生异常综合征[18]等。由于PI3K/Akt信号通路与肿瘤发生及侵袭转移有紧密关系，可能是肿瘤治疗及抗肿瘤药物研发的新靶点。本文结果显示，MS-275显著降低原代培养胶质瘤细胞和和GSCs 中p-PI3K/PI3K水平，表明MS-275抑制p-PI3K/Akt 信号通路。

综上所述，MS-275促进原代培养的胶质瘤细胞和GSCs 凋亡，同时抑制细胞增殖，可能是通过抑制p-PI3K/Akt 信号通路实现的；但是GSCs 对MS-275仍然有一定的耐药性。