IL-17通过NF-κB信号通路参与胃癌发生发展的免疫调控

李春波，苏 韫*，龚红霞，薛 轩，李婷婷，牛世伟，聂 蓬

(1.甘肃中医药大学 基础医学院，甘肃 兰州 730000； 2.甘肃中医药大学 甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000； 3.甘肃省武威肿瘤医院 武威医学科学院胃外科， 甘肃 武威 733000)

胃癌(gastric cancer)是消化道最常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率在世界范围内分别居第5位和第3位[1]。炎性反应被称为肿瘤的十大特征之一[2]。长期的慢性炎性反应可损伤胃黏膜，进而发展成胃癌[3]。炎性细胞分泌的各种炎性因子通过不同途径促进肿瘤的发生及转移，因此抑制炎性反应是防治胃癌的关键环节之一。白介素-17(interleukin-17,IL-17)是促炎的细胞因子，可引起核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路激活，引起下游效应因子转录，促进细胞增殖，血管生成，参与机体的炎性反应，促进胃癌的发生发展。本研究拟通过实验，探讨IL-17/NF-κB信号通路在胃癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象： 根据纳入排除标准收集并筛选2018年1月至2018年12月在甘肃省武威肿瘤医院接受手术治疗的30例胃癌患者及同期于本院进行健康体检的30名健康人,并收集血清。收集胃癌患者的胃癌组织、癌旁组织(距离癌组织5 cm)及远离胃癌组织的胃组织各(距离癌组织10 cm)30例。本研究经武威肿瘤医院医学伦理委员会批准(审批文号：WWZL-LL-2016-0001)。纳入标准：经病理组织学确诊的胃癌患者；病历资料完整者；入选者依从性良好、自愿接受相关检查及实验措施。并签署书面知情同意书。排除标准：机体患有免疫系统疾病的患者；胃癌合并其他部位恶性肿瘤者；无法获取完整资料的患者。

1.1.2 试剂及试剂盒： IL-17、IL-6、IL-8 ELISA试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司)；兔抗人IL-17、IKK-β、pNF-κB p65和IL-6抗体(GeneTex公司); 鼠抗人NF-κB p65抗体(Immunoway公司)；DAB显色试剂盒和SP试剂盒(链霉卵白素-生物素法检测系统)(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 胃癌患者胃组织病理学观察： 所有患者的组织标本取材后，用10%甲醛溶液固定12～24 h，石蜡包埋，制备成4 μm厚的石蜡切片。胃组织切片常规脱蜡至水后，苏木精伊红(HE)染色封片后，于光学显微镜下观察组织病理变化。

1.2.2 ELISA检测血清IL-17、IL-6和IL-8含量： 采集空腹静脉血，分离血清，-80 ℃保存；用ELISA试剂盒检测血清中IL-17、IL-6和IL-8水平。操作严格按照说明书进行。

1.2.3 免疫组织化学法检测相关蛋白的表达： 将石蜡切片常规脱蜡后清洗3次。3% H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min, PBS缓冲液清洗3次后进行抗原修复，加入一抗，湿盒内4 ℃过夜。清洗后加入二抗，37 ℃孵育30 min。DAB显色，脱水封片后在光学显微镜下观察。镜下顺序放大200倍，随机选取10个视野进行图像采集。IL-17、IL-6、IKK-β和NF-κB p65蛋白表达阳性为胞质或胞核内出现棕黄色颗粒。用Image J软件分析平均吸光度(A)值=积分吸光度(A)/阳性目标阳性面积(Area)。

1.2.4 Western blot检测相关蛋白： 提取组织蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度,-20 ℃保存备用。取等量蛋白进行SDS-PAGE，将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭液室温孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，按照说明书使用要求加入一抗稀释液，于4 ℃孵育过夜。TBST洗膜10 min×3次后，加入二抗稀释液在室温下摇床孵育1.5 h，TBST洗膜10 min×3次后曝光。使用Image J软件对蛋白条带进行吸光度值计算，与内参比较，分析相对蛋白表达。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 健康对照组与胃癌患者一般资料

健康人群与胃癌患者性别及年龄差异无统计学意义。

2.2 HE染色结果

正常胃组织上皮排列整齐，着色浅呈透明状，上皮下陷形成胃小凹，皱襞完整；主细胞呈柱状或椎体状细胞质染成淡蓝色，细胞核呈卵圆形；壁细胞呈卵圆形或三角形，细胞质染成红色，细胞核呈椭圆形 (图1A)。

癌旁组织中腺体大小形状不规则，排列紊乱，上皮细胞变薄腺腔增大，伴肠上皮化生，出现杯状细胞，有黏液分泌。有少量癌细胞的浸润，核出现一定的异型性，间质中有少量炎性细胞浸润 (图1B)。

胃癌组织腺腔大小不一，腺上皮层次多，排列紊乱；癌细胞异型性明显，突破了黏膜肌层向间质浸润，排列紊乱呈不规则条索状或巢状，细胞核大小不一，病理性核分裂像多见，血管增多，细胞间质见纤维增生及大量炎性细胞浸润 (图1C)。

2.3 ELISA检测结果

与健康对照组相比，胃癌患者IL-17、IL-6、IL-8表达上升(P<0.05)(表1)。

表1 IL-17、IL-6、IL-8在各组中血清浓度

*P<0.05 compared with healthy control group.

2.4 免疫组化结果

与正常、癌旁组织相比，胃癌组织中IL-17和IKK-β阳性表达主要定位于细胞质，IL-6和NF-κB p65阳性表达定位于细胞核和细胞质，为棕黄色或棕褐色颗粒见(图2～图5)。IL-17、NF-κB p65、IKK-β和IL-6在胃癌组织中的表达明显高于正常和癌旁组(P<0.05)(表2)。

2.5 Western blot检测结果

与正常胃组织相比，胃癌组织中IL-17、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IKK-β和IL-6表达增加(P<0.05)；癌旁组织中pNF-κB p65、IKK-β和IL-6表达增加(P<0.05)。与癌旁组织相比，胃癌组织中IL-17、NF-κB p65、pNF-κB p65、IKK-β和IL-6表达增加(P<0.05)(图6，表3)。

图1 正常组织(A)、癌旁组织(B)、胃癌组织(C)组织病理学变化

图2 IL-17在正常组织(A)、癌旁组织(B)、胃癌组织(C)中的表达

图3 IL-6在正常组织(A)、癌旁组织(B)、胃癌组织(C)中的表达

图4 NF-κB p65在正常组织(A)、癌旁组织(B)、胃癌组织(C)中的表达

图5 IKK-β 在正常组织(A)、癌旁组织(B)、胃癌组织(C)中的表达

表2 免疫组化检测各组蛋白的表达

*P<0.05 compared with the normal group;▲P<0.05，comparison with the normal adjacent group.

图6 IL-17、IL-6、NF-κB p65、pNF-κB p65和IKK-β在各组的表达

3 讨论

胃癌的发生发展是多种因素作用的结果[4]。慢性胃炎被认为是胃癌的关键因素之一。近年来，随着炎性反应与肿瘤的深入研究，慢性胃炎的“炎-癌转化”模式已成为研究的热点[5-6]。因此有效地抑制慢性胃炎向胃癌的进展是关键所在。

IL-17是由辅助性T细胞(Th17)特异性分泌的促炎细胞因子[7-8]，IL-17可诱导早期免疫介质的分泌，使炎性反应细胞聚集到损伤部位。当发生炎性反应时，IL-17可与细胞表面的IL-17R特异性结合，激活IκB激酶，从而导致IκB蛋白磷酸化，泛素化降解，导致NF-κB二聚体释放后通过各种翻译后的修饰作用而被进一步激活，进入到细胞核中与目的基因结合，发挥转录作用。持续的炎性反应可使NF-κB的表达增加，激活NF-κB信号通路下游的效应基因IL-6、IL-1、TNF-α、IL-8、COX-2、MMP-9和VEGF等表达增加[9-10]，参与机体炎性免疫反应、细胞凋亡等病理过程，导致胃癌的发生发展。本研究选择了IL-17活化的NF-κB信号通路中的几个关键蛋白作为检测指标，旨在探索IL-17通过NF-κB信号通路参与胃癌发生发展的免疫调控机制。

IL-17在肺癌[11]、肝癌[12]和胃癌[13]中均有明显表达，有研究表明，IL-17在胃癌组织中表达显著增高[14]。也有研究[15]发现，胃癌患者外周血中IL-17水平显著升高, 并且与患者临床分期有关。提示，IL-17可能在胃癌发生发展的过程中起促进的作用。本实验的研究结果显示，不论是胃癌患者的血清中还是癌组织中的IL-17含量均明显升高，这与报道的结果一致。本研究通过对胃癌患者组织中NF-κB相关通路蛋白NF-κB p65、pNF-κB p65、IKK-β、IL-6及血清IL-6的检测结果表明，胃癌患者血清中IL-6表达上升，胃癌组织中NF-κB p65、pNF-κB p65、IKK-β和IL-6表达增加；癌旁组织中pNF-κB p65、IKK-β和IL-6表达增加。与正常癌旁组织相比，胃癌组织中IL-17、NF-κB p65、pNF-κB p65、IKK-β和IL-6表达增加。说明IL-17的含量增高，可激活NF-κB信号通路，使NF-κB表达量增加，引发 NF-κB 信号通路下游的 IL-6表达增加，导致炎性反应的扩大及胃癌的发生与发展。

表3 IL-17、IL-6、IKK-β、NF-κB p65及p-NF-κB p65的表达

*P<0.05 compared with the normal group;▲P<0.05 comparison with the adjacent group.

IL-17可通过NF-κB信号通路刺激下游效应因子发生转录，参与胃癌的免疫调控以及促进胃癌的发生发展。因此，研究IL-17及其参与作用的相关信号通路在胃癌形成、进展及预后中所起的作用是防治胃癌的关键环节之一，对胃癌的治疗及预后均具有重要意义。