NLRP3基因多态性与中国北方东部汉族人群帕金森病相关性研究☆

王慧敏 刘贤 李珊珊 金佳宁 白新玲 谢安木○☆

帕金森病（Parkinson disease，PD）是仅次于阿尔茨海默病的第二大中枢神经系统退行性疾病，PD的致病机制尚不明确，近年来，炎症在PD及其并发症中的作用引起了人们的广泛关注，目前越来越多的研究表明炎症可通过介导多巴胺能神经元变性导致PD发病[1-3]。核苷酸结合域样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体在炎症过程中起重要作用，其结构由NLRP3、衔接蛋白、凋亡相关斑点蛋白和促炎性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1组成[4]。通过病原体相关分子模式和损伤相关分子模式激活后，NLRP3组装并导致成熟促炎细胞因子如IL-1等分泌。研究发现小胶质细胞中NLRP3炎症小体激活可导致1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-menthyl-4-phenyl-1,2,3,6 tetrahydropyridine,MPTP）模型PD中的多巴胺能神经元变性[5]。多项研究表明NLRP3基因多态性与许多免疫炎症疾病有关，如阿尔茨海默病[6]，2型糖尿病[7]，先兆子痫[8]等。据研究报告，位于内含子7的rs4612666可影响NLRP3的表达[9]，最新研究发现rs7525979位点位于核苷酸寡聚结构域 （nucleotide-binding oligomerization,NACHT），其多态性与美国罗克维尔市人群帕金森病有关[10]，但是我国尚无PD中此位点的研究报告。综合分析推测，本研究从NLRP3基因上选取了这2个重要位点，旨在探讨中国北方东部汉族人群NLRP3基因多态性与帕金森病的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 连续收集2017年12月至2019年3月就诊于青岛大学附属医院神经内科门诊及住院的400例PD患者纳入PD组，其中男214例，女186例，早发型PD 65例（发病年龄≤50岁），晚发型PD 335例（发病年龄＞50岁）。纳入标准：①符合英国帕金森病协会脑库临床诊断标准[11]；②年龄＞45岁，性别不限；③中国北方东部汉族人群；④排除家族性帕金森病、继发性帕金森病以及其他神经系统或精神疾病。另外收集同期该地区年龄、性别种族相匹配，且家族中无神经系统退行性疾病家族史的健康体检者400例纳入对照组,其中男221例，女179例。本研究通过青岛大学附属医院伦理委员会的批准 （伦理编号：QYFYWZLL25603），所有的研究对象均知情并签署知情同意书。

1.2 研究方法 采集研究对象外周静脉血2 mL于EDTA抗凝管中。使用TIANamp Blood DNA Kit试剂提取外周血DNA。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性 （polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism,PCRRFLP）方法分离基因型，PCR引物序列使用Gene tool(Primer Premier 5.0)设计。rs4612666的 PCR 引物序列:F:TGCTTAAGGCCATTAATTGTG，R:CTCCACCATGGACAAGGAAG。rs7525979的PCR引物序 列 ：F:CACGACTGCGTCTCATCAA，R:ACGCCCAGTCCAACATCA。

PCR 反应体系共 25 μL，包括 DNA 模板 3 μL，上下游引物各 1 μL，2×TaqMasterMix 12.5 μL，双蒸水 7.5 μL，rs4612666 的反应条件为：95℃预变性 3 min；95℃变性 30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃延伸 7 min。 rs7525979的反应条件：94℃预变性 4min，94℃变性 30s，62.2℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环后，72 ℃延伸5 min。PCR反应结束后，6 μL的PCR产物使用限制性内切酶 BbsI （rs4612666）37 ℃温水浴 4 h；TspRI（rs7525979）65℃温水浴 2 h， 进行酶切反应，7 μL PCR酶切产物加样于2.5%琼脂糖凝胶中进行凝胶电泳后，使用紫外仪成像观察并拍照。为了验证结果的准确性，随机选取10%的样本进行测序，结果一致。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，用Hardy-Weinberg平衡检验样本群体代表性（P＞0.05）。计量资料采用两独立样本的t检验；计数资料采用卡方检验。基因型-疾病的相关性采用logistic回归分析。以OR及95%CI表示相对危险度。设置检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 一般资料 一般资料显示病例组与对照组的性别、年龄分布差异均无统计学意义（表1）。

2.2 Hardy-Weinberg平衡试验 PD组与对照组NLRP3基因 rs4612666、rs7525979基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律 （P＞0.05）（表2）。

2.3 SNPs与帕金森病的关联性分析 如表2所示，在PD组与对照组之间，使用logistic回归分析，校正年龄、性别因素。PD组中rs4612666多态位点CC基因型频率显著低于对照组 （OR=0.621,95%CI：0.417～0.926,P=0.019），两组等位基因频率差异具有统计学意义，携带C等位基因降低 PD 发病风险 （OR=0.794，95%CI：0.653～0.967，P=0.021）。在隐性遗传模式（CC/TT+TC）分析中有显著差异（P=0.015）。rs7525979多态位点的基因型及基因频率分布在PD组与对照组间差异无统计学意义，且在不同遗传模型分析下差异均无统计学意义。

2.4 SNPs与帕金森病性别年龄分层的关联性分析如表3所示，运用logistic回归分析，校正年龄因素，在rs4612666多态性位点，女性PD患者C等位基因频率及CC基因型较对照组显著减少（OR=0.644,95%CI：0.481～0.863，P=0.003；OR=0.420,95%CI：0.234～0.756,P=0.004）。 运用logistic 回归分析，校正性别因素，早发型PD患者C等位基因频率较对照组显著降低 （OR=0.636,95%CI：0.437～0.926,P=0.018）。在隐性遗传模型中，女性PD和早发型PD与对照组比较差异具有统计学意义（P=0.002，P=0.013）。 表 4 示，rs7525979 位点的基因分布及基因频率在年龄及性别亚组分析中，与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 PD组与对照组的人口学资料

表2 PD组和对照组NLRP3基因各SNP位点基因型及等位基因频率比较

3 讨论

近年来研究发现炎症可能在PD的发病机制中起重要的作用[12-14]。NLRP3作为近年来研究热点，在PD发病中起关键作用。NLRP3基因位于1q44染色体上，编码蛋白产物为NOD样受体家族成员。先前研究证实NLRP3基因多态性的多个位点突变易患常见的炎症性疾病[15]。研究发现激活NLRP3炎性小体促进炎性细胞因子IL-β分泌表达，加重神经炎症，促进PD发展[16-19]。NLRP3介导的神经炎症可能导致PD中多巴胺神经元变性，加重PD的过程[20]，2018年 QIAO等[21]研究发现MPTP模型中NLRP3的表达上调且抑制肝脏中NLRP3炎性小体的激活可以减轻MPTP引起的神经损伤，表明NLRP3炎性小体激活可能与PD的发病机制有关。此外2018年VON HERRMANN等[10]通过组织学研究发现PD患者中脑多巴胺神经元的NLRP3表达升高。这些研究表明NLRP3可能是PD的合理的功能候选基因。

表3 NLRP3基因rs4612666位点亚组基因型及等位基因频率比较

表4 NLRP3基因rs7525979位点亚组基因型及等位基因频率

本研究是首次在中国北方东部汉族人群中探讨NLRP3基因多态性与帕金森病的关系。结果显示NLRP3基因rs4612666位点多态性与PD易感性有关，PD组CC基因型以及C等位基因频率均显著低于对照组，提示该位点CC基因型及C等位基因携带者患PD的风险降低，C等位基因可能是一个独立的保护性因素。对于rs7525979位点多态性分析中尚未发现统计学差异。在性别分层分析结果发现，rs4612666位点基因型及基因频率分布在女性PD与对照组间有统计学差异，而对男性PD的发生无显著影响。我们推断PD的发病机制可能在性别上有所不同。此外，在年龄分层分析显示rs4612666位点的基因型分布在早发PD与对照组之间差异具有统计学意义，我们推测遗传因素可能在PD发病年龄的发生发展中发挥关键作用。

rs4612666多态性位于内含子7中。2009的HITOMI等[9]以及2017的ZHAO等[22]研究结果发现，与T等位基因相比rs4612666的C等位基因可通过提高转录增强子的作用或增加mRNA的稳定性进而提高mRNA的表达量，并增强NLRP3表达。而且C等位基因与食物引起过敏反应、阿司匹林引起的哮喘和ASA20的风险增加有关。而2015年CHENG等[23]对急性肾盂肾炎和急性叶性肾炎研究显示病例组的 CC基因型显著低于对照组，CC基因型可能是急性肾盂肾炎和急性叶性肾炎的保护性因素。同样，我们发现 rs4612666等位基因C及基因型CC可能降低中国北方东部汉族人群患PD的风险，这表明C等位基因中较高的转录增强子活性可能不适用于我们的研究结果。不同的疾病及种族人群可能解释这些相反的结果，因部分NLRP3 SNPs在HapMap人群中具有不同的等位基因频率。此外我们也无法排除rs4612666与目前尚未确定的可能调控该基因表达或功能的偶然变异之间存在强连锁不平衡的可能性。但我们尚未进行任何实验来研究rs4612666如何影响NLRP3炎性小体的表达，可以进一步研究NLRP3影响PD发病的分子机制。rs7525979位于NACHT结构域，2018年VON HERRMANN等[10]研究发现rs7525979与降低PD发病风险有关。而我们的研究尚未发现rs7525979位点多态性与PD发病风险相关，种族差异和相对较小的样本量可能是造成不同结果的原因。

近年来发现基因多态性与PD临床症状相关。2019 年 SI等[24]发现 ɑ-突触核蛋白（SNCA）rs11931074多态性可能会调节中国PD患者的脑功能并与运动症状严重程度有关。2019年ZHI等[25]发现多巴胺受体D3（DRD3）基因Ser9Gly多态性可能与PD患者以快感不足为特征的抑郁症严重程度有关。2012年DE LAU等[26]发现儿茶酚胺氧位甲基转移酶（COMT）Val158Met基因多态性与PD运动障碍有关。这些研究表明基因多态性与PD临床特征有关。本研究在发现NLRP3基因多态性与PD发病风险的基础上，未来需进一步就临床特征的相关性进行研究，阐明分子机制，为PD分子标志物的发现和诊断治疗提供依据。

本研究是单中心研究，因此样本量相对较少及SNPs位点数量有限，NLRP3基因多态性与PD相关性仍需继续观察，因此对关联性结论推断需谨慎。结论需要在大样本人群、多中心的临床研究中进一步加以验证。