石墨烯对白榆扦插苗生长和生理生化特征的影响

张晓 ，曹慧芬 ，赵建国 *，王海雁 ，姚建忠 ，王俐彤 ，张倩琦 ，马利娟

（1.山西大同大学炭材料研究所，山西大同037009；2.山西大同大学生命科学院，山西大同037009；3.山西省桑干河杨树丰产林实验局，山西大同037006）

白榆（Ulmus pumilaL.），多年生落叶乔木，是我国北方重要的用材林和园林绿化树种［1］。白榆的根系发达，具有生长速度快、抗干旱、抗严寒、耐贫瘠等优点，是适宜北方干旱、半干旱气候和盐碱环境的优良树种，对于防治空气污染、土壤修复、防风固沙等具有重要作用［2］。

石墨烯作为一种二维碳纳米片层材料，因其独特的理化性质，优异的电学、热学、机械性能以及比表面积大等优点，已在电化学、生物医学、催化和复合材料等诸多领域广泛应用［3］，而在农林业领域，石墨烯的应用才刚刚开始。随着对石墨烯的深入研究和广泛应用，人们对石墨烯生物效应的了解越来越丰富［4］。有研究表明石墨烯可以被水稻根系吸收，并转运到地上部器官，最终被分解成CO2［5］。在固体培养基中，适宜浓度的石墨烯处理可以促进草本植物藜麦［6］以及木本植物欧洲山杨［7］、树莓［8］组培苗的根生长，并能增加植物的生物量。在液体培养基中，200 mg·L-1的水合石墨烯带处理可以促进衰老小麦种子萌发和根系分化［9］。在土壤中，50 mg·L-1的氧化石墨烯处理菠菜和细香葱可以加速其种子萌发［10］；50 和 200 mg·L-1的氧化石墨烯处理陆地棉和长春花后可以加速种子萌发、促进根系和地上部生长，诱导提前开花并能增加花器官的生物量［11］。石墨烯促进植物生长的机理，目前已有许多研究。首先，石墨烯片层边缘被含氧基团修饰后具有良好的水分传导性能，可以促进植物的种子和植株的水分吸收［10］。其次，石墨烯处理可以改变植物体内的基因表达和代谢活动，促进植物的根、茎、叶等器官的生长［4，6～8，12，13］。此外，石墨烯可以缓解土壤中的重金属Cd2+对水稻芽和种子根以及玉米幼苗生长的毒害效应［14］。目前，石墨烯影响植物生长的研究大多集中于草本植物，少数针对木本植物的研究则是在培养基中进行，而在植物的实际生长环境土壤中，石墨烯对木本植物生长的影响目前少见报道。

叶片的光合作用及根系的吸收能力是决定树木存活和生长速度的重要因素。光合作用是植物生长的基础，为植物提供物质和能量［15］，根系吸收能力是保证植物水分、矿质元素供应的基础［16］。在光照、CO2浓度等环境条件一致的前提下，影响光合作用的内部因素主要有叶绿素含量和气孔特征等。研究表明：在一定范围内叶绿素含量与光合速率呈负相关关系［17］，而气孔密度和气孔导度与光合速率呈正相关关系［18］。植物根系吸收能力主要由根系的生物量、根系形态和根系活力共同决定［16］。

为了解析土壤中石墨烯处理对林木生长的影响，本文以白榆扦插苗为研究材料，通过分析石墨烯处理后扦插苗新生器官的生物量及生理生化指标，并从光合效率和根系吸收能力2 个方面解释石墨烯影响白榆扦插苗生长的作用机理，旨在为石墨烯在林木培育领域的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试白榆扦插枝条由山西省桑干河杨树丰产林实验局提供，所采枝条为白榆树当年生枝条，枝条直径0.5～0.6 cm，将枝条剪为约20 cm 长的茎段作为插穗，采样时间为冬季12 月份。试验使用的石墨烯由山西大同大学炭材料研究所提供，含有一定量的COOH 和C-OH 官能团修饰，因而可以与水形成氢键，并稳定的存在于水溶液中形成石墨烯溶胶［6～8］。根据草本植物菠菜、细香葱、陆地棉和长春花在土壤中石墨烯处理实验［10，11］，并结合我们前期土壤中多种植物处理预实验结果，本次实验石墨烯处理浓度为50 mg·L-1。

1.2 试验设计

试验用土为草炭土、蛭石和珍珠岩按照2∶1∶1的比例混合而成。将插穗基部在深度为5 cm，浓度为 50 mg·kg-1的 ABT1 生根粉中浸泡 2 h，并分别插入用水或50 mg·L-1的石墨烯溶液浇透的土中。将扦插苗转移入光照周期为8 h 黑暗/16 h 光照，温度为23℃，湿度为50%的培养室中培养，每10 d 用水或50 mg·L-1的石墨烯溶液处理一次。扦插苗生长60 d 后进行观察，每个处理有15～20 个植株，试验重复3 次。

1.3 试验方法

1.3.1 生物量测定

将白榆扦插苗从土壤中取出，用自来水将根上附着的土冲洗干净，用滤纸吸干表面水分。将枝条上新长出的茎叶及根系剪下，分别在电子天平上称重。

1.3.2 生理生化指标测定

植物叶片在万分之一天平称重后，在烘箱中110 ℃杀青 10 min，80 ℃烘干至恒重，再次称重，植物含水量=（鲜重-干重）/鲜重；可溶性糖含量利用蒽酮法进行测定；叶绿素用95%乙醇提取后，利用INESA L6S 紫外可见分光光度计，分别测量663 nm 和 645 nm 下的吸光度，利用公式 Ca=12.7·A663-2.59·A645， Cb=22.9·A645-4.67·A663计算叶绿素a 和叶绿素b 的含量；根系活力利用北京雷根生物技术有限公司植物根系（脱氢酶）活力检测试剂盒（TTC 比色法）分析。

1.3.3 叶片光合特征及光合荧光测定

净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率、水分利用效率等光合特征指标使用美国PP SYSTEMS 公司CIRAS-3 便携式光合仪测定，测定时间为上午 7：00 到 11：00；PSII 实际光化学效率（YII）和PSII 最大光化学效率（Fv/Fm）利用德国WALZ 公司PAM-2500 便携式调制叶绿素荧光仪测定，测定时间为 19：00 到 22：00［19］。

1.3.4 气孔分布特征值测定

植物叶片气孔分布特征值采用指甲油印迹法测定［20］，选取大小一致的叶片，在叶片背面中间远离主脉位置涂抹指甲油，待指甲油干后将其撕下并压片。将指甲油印记切片放于40 倍光学显微镜下观察并拍照，每个处理取5 个叶片，每张片子选取3 个视野拍照，利用ImageJ 软件测量照片中的气孔数量、气孔长度、气孔宽度和气孔面积，并计算气孔密度（个·mm-2）。

1.3.5 根系形态分析

将洗净土的根系放入扫描仪中扫描，然后利用根系分析系统（WinRHIZO）对根总长度、根表面积进行分析。

1.4 统计分析

数据利用SPSS22.0 软件进行t 检验，并利用Excel 2017 软件作图，显示的数据均为3 次重复的平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 石墨烯对白榆扦插苗生物量的影响

白榆插穗插入基质中，其茎段基部再生形成根，梢部再生形成茎、叶。新生茎叶和根的鲜重代表了扦插苗的生长速度。石墨烯处理明显可以促进白榆扦插苗的茎叶和根系生长（图1）。与对照相比，石墨烯处理使新生茎叶的鲜重增加了36.13%，而根系鲜重增加了19.69%（表1）。

图1 石墨烯处理后白榆扦插苗植株形态变化Fig.1 The plant morphological change of elm cutting seedlings after graphene treatment

表1 石墨烯处理对白榆扦插苗新生器官鲜重的影响Table 1 Effects of graphene on fresh weight of new organs of elm cutting seedlings

为了分析石墨烯处理后白榆扦插苗鲜重的增加是由于水分还是有机物含量的增加，我们测定了扦插苗叶片的含水量及可溶性糖含量。如表2所示，石墨烯处理并没有明显改变白榆扦插苗叶片的含水量，却显著提高了叶片的可溶性糖含量。与对照相比，石墨烯处理使白榆扦插苗的可溶性糖含量提高了43%。这个结果说明植物生物量的增加并非由于含水量增加，而是由于有机物的积累增加。植物体内有机物来源于光合作用，植物可溶性糖含量的提高以及生物量的增加暗示，石墨烯处理可能提高了白榆扦插苗的光合效率。

表2 石墨烯处理对白榆扦插苗叶片含水量和可溶性糖含量的影响Table 2 Effects of graphene on water content and soluble sugar content of elm cutting seedlings leaves

2.2 石墨烯对白榆扦插苗光合作用的影响

为了分析石墨烯处理对白榆扦插苗叶片光合作用的影响，首先对扦插苗的光合特征进行测量。如表3 所示，石墨烯处理显著提高了白榆扦插苗的胞间CO2浓度、气孔导度和净光合速率等光合特征参数。与对照相比，3 个参数分别提高了13.04%、158.06%和28.97%。植物光合效率提高的同时，石墨烯处理也使叶片蒸腾速率比对照显著提高了31.77%，因而植物水分利用效率并没有发生显著改变。此外，测量植物光合荧光参数，结果如表4所示。石墨烯处理使植物PSII 实际光化学效率（YII）显著提高了19.15%，而最大光化学效率（Fv/Fm）并未受到显著影响。植物光合作用是由叶绿素吸收光能，并转化为化学能的光反应，和在一系列酶的作用下将CO2和水转化形成糖的暗反应组成。植物的叶绿素以及胞间CO2浓度是影响植物光反应和暗反应的重要因素，而气孔作为叶片气体交换的通道，是决定气孔导度、胞间CO2浓度以及蒸腾速率的重要因素。

叶绿素是植物叶绿体吸收光能进行光合作用的关键物质，也是光合作用第一步光反应的主要成分。叶绿素含量会影响植物的光反应，进而影响光合效率［17］。为了分析石墨烯影响白榆光合效率的原因，我们首先测定了处理组与对照组的叶绿素含量。由表5 可见，石墨烯处理对白榆叶绿素a、叶绿素b 含量以及叶绿素a/b 值无显著影响。

表3 石墨烯处理对白榆扦插苗叶片光合特征的影响Table 3 Effects of graphene on photosynthesis characteristics of elm cutting seedlings leaves

表4 石墨烯处理对白榆扦插苗叶片光合荧光参数的影响Table 4 Effects of graphene on photosynthesis fluorescence parameters of elm cutting seedlings leaves

表5 石墨烯处理对白榆扦插苗叶片叶绿素含量的影响Table 5 Effects of graphene on chlorophyll contents of elm cutting seedlings leaves

石墨烯处理后白榆扦插苗叶片的胞间CO2浓度、气孔导度和蒸腾速率显著提高，说明石墨烯处理可能改变了扦插苗叶片表皮气孔形态。石墨烯处理后，植物叶片表皮气孔结构与对照没有明显差异。对气孔密度、气孔面积等气孔特征进行统计分析后发现：石墨烯处理并没有显著改变气孔长度、气孔宽度和气孔面积等大小指标，但是使气孔密度显著提高9.96%（表6）。

表6 石墨烯处理对白榆扦插苗叶片气孔特征的影响Table 6 Effects of graphene on stomatal traits of elm cutting seedlings leaves

2.3 石墨烯对白榆扦插苗根系形态和根系活力的影响

植物的根系形态（根长、根表面积）和根系活力是影响植物吸收能力的重要因素［16］。如表7 所示，石墨烯处理显著影响了白榆扦插苗的根系形态。与对照相比，石墨烯处理使白榆扦插苗的总根长和根表面积分别提高了14.59%和14.58%。与根系形态不同，石墨烯处理对白榆扦插苗的根系活力没有显著改变。

表7 石墨烯处理对白榆扦插苗根系形态性状和根系活力的影响Table 7 Effects of graphene on root morphology characters and root vigor of elm cutting seedlings

3 讨论与结论

植物作为一个固着生长的生物，由地下根系与地上茎叶等器官组成。根系吸收水分和矿质元素，并运输到地上器官；而地上器官进行光合作用，并将有机物运输到根系［21］。石墨烯处理提高了白榆扦插苗地上茎叶和地下根系的生物量，其中地上器官较地下根系鲜重增加更为显著。

石墨烯处理后白榆扦插苗叶片含水量没有明显变化，而可溶性糖含量显著增加，这说明石墨烯处理主要促进白榆有机物的积累。有机物主要是在叶片通过光合作用形成，白榆叶片有机物含量增加表明石墨烯处理可能提高了白榆的光合效率。石墨烯处理后白榆的叶片净光合效率提高的同时，气孔导度、蒸腾效率和胞间CO2浓度都发生显著提高，这说明石墨烯处理导致的光合速率提高主要与叶片气孔因素相关［22］。石墨烯处理后白榆PSⅡ实际光化学效率（YⅡ）提高，而PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）和叶绿素含量没有明显变化，表明植物的光反应系统没有明显变化［23］。气孔特征统计结果表明石墨烯处理没有影响气孔大小，而显著增加了叶片的气孔密度。这些结果说明石墨烯处理导致白榆扦插苗气孔密度增加，进而引起气孔导度和胞间CO2浓度提高，最终提高光合速率。

根系是植物与土壤接触的桥梁，扦插苗的根系不仅是植物生物量的重要组成部分，也是决定扦插苗吸收能力的重要因素。通过对白榆扦插苗的根系进行分析表明：石墨烯处理可以显著促进白榆的根系生长，提高总根长和总根表面积，却并没有显著改变扦插苗根系的根系活力。这些结果说明：石墨烯处理可以通过促进白榆扦插苗的根系生长，扩大植物的吸收面积，从而为植物生长提供充足的营养。

在溶液和固体培养基中的研究表明，石墨烯的生物效应与其使用浓度密切相关，大多表现为低浓度促进，高浓度抑制的双重作用［6～8，24］。在土壤中对草本植物的研究表明，50 和 200 mg·L-1的石墨烯处理表现为促进植物生长的效应［10，11］。我们的研究发现50 mg·L-1石墨烯处理木本植物白榆扦插苗后，植物根系及地上部的生物量相比对照都出现显著增加。在未来的研究中，有必要进一步探讨不同浓度石墨烯处理对木本植物生长的影响，更好地指导育苗和生产活动。

石墨烯增加根系吸收面积和提高叶片可溶性糖含量的作用具有重要的应用价值。首先，植物根系结构是一个重要的耐旱性指标，林木根系的深度和广度是干旱条件下林木存活的重要影响因素［25］。此外，可溶性糖是植物体内重要的渗透调节物质，可溶性糖含量对干旱胁迫下植物的渗透调节具有重要作用［26］。石墨烯处理可能有增强植物的抗旱性的作用，对于干旱地区林木栽培具有重要意义。石墨烯可以成为一种新型生长促进剂应用于林木生产，未来随着对石墨烯促进植物生长机理的认识越来越深刻，石墨烯在农林业领域的应用前景必将更加广阔。