晋南驴mtDNA D-loop 区部分序列系统进化分析与体型测定

李慧锋 ，赵婧微 ，陈员玉 ，程俐芬 ，曹宁贤 ，解建平 ，靳鲁柱 ，李武峰

（1.山西农业大学生命科学院，山西太谷030801；2.山西省畜禽繁育工作站，山西太原030001；3.临汾市畜禽繁育改良工作站，山西太原041000；4.曲沃县晋合泰农副产品有限公司，山西曲沃043400）

我国是世界上驴的驯化和养殖最早的国家之一，我国的驴按体格大小可以分3 类：大型驴、中型驴、小型驴，大型驴分布在古代农业较为发达、饲料条件好的中部平原和丘陵地区，主要包括关中驴、庆阳驴、德州驴、晋南驴等。晋南驴是山西地方品种，主产于山西南部的运城市和临汾市南部的黄土高原地形区，具有体格高大、体型优美、头部清秀等特点，是我国优良的大型驴种之一［1］。近20 年来，由于社会经济的快速发展，农业和运输业的迅速兴起，中国晋南驴种质资源数量已经大为减少，驴群数量大幅下降。

线粒体 DNA（ Mitochondrial DNA，mtDNA）是核外遗传物质，其具有稳定的结构，在世代传递的过程中不发生重组，且具有单性母性遗传方式［2］。因此，驯化了的家畜一般能保持其祖先mtDNA 类型。作为一种遗传标记，线粒体DNA对于研究家畜的起源进化研究、畜群遗传结构分析等方面都具有重要的意义。线粒体DNA 控制区（又称D-环区，displacement loop region）也叫控制区，是线粒体DNA 中的一段富含A、T 碱基的非编码区，属于遗传高变区，进化速度快，多态性丰富，已成为动物mtDNA 的研究热点之一。

驴的mtDNA 基因组为16 670bp，其中D-loop区的全序列为1 207bp［3］。近年来，国内外开展了一些驴的 mtDNA 研究［4，5］，这些研究主要讨论了不同驴种的进化关系等问题。晋南驴mtDNA D-loop 多态性进行深入分析的报道较少，且多年来没有对晋南驴这一重要的地方品种开展成规模的体型测定工作。因此本文以晋南驴为研究对象，利用PCR 测序技术检测mtDNA D-loop 部分序列多态性，分析了晋南驴种的亲缘关系，并就晋南驴的体型测定结果进行了分析，为进一步开展晋南驴这一地方品种的保护工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本

试验所用晋南驴血样共99 个，均采自山西省曲沃县晋合泰农副产品有限公司。该公司用于本研究的驴均有购买记录，来源于曲沃、夏县、闻喜、侯马、翼城、襄汾、临汾、新绛等地。每头驴颈部采集血液 5 mL，用肝素钠作为抗凝剂，-20℃保存备用。

1.1.2 PCR 引物

PCR 所用引物根据 Xu 等［3］已经发表的欧洲驴线粒体DNA 全序列进行设计，设计出两条引物A（序列2-322）和B（序列483-671）。

引物 A（序列 2-322）的正链引物为 5’-GGATTGGGACACGTAATTGG-3’，反链引物为 5’-TTTCCTCCCCTAAACGACAG-3’。引物 B 的正链引物为 5’-TGTGGGTGTGCATGTTCTTT-3’，反 链 引 物 为 5’-CTGTGGTTTCATGCATTTGG-3’，均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要试剂

肝素、生理盐水、盐酸、氢氧化钠、三羟基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、十二烷基磺酸钠（SDS）、琼脂糖（Agarose）、Tris 饱和酚（碱性pH 7.8～8.0）、氯仿、异戊醇、无水乙醇，蛋白酶K，均购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 提取

按照QIAquick® PCR 纯化试剂盒的使用方法，从99 个晋南驴血样中提取基因组DNA。使用Nanodrop 确定提出的DNA 浓度和纯度，-20℃保存备用。

1.2.2 PCR 扩增、产物的检测及测序

反应体系为20 μL，其中2×Taq PCR Master-Mix 10 μL，上游下游引物各 0.8 μL，样品 2.0 μL及 PCR 水 6.4 μL。反应条件：94 ℃ 预变性 2 min，35 个 循 环 程 序 为 ：94 ℃ 变 性 30 s，54.2 ℃ ～56.2 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，循环结束后 72 ℃延伸2 min。

用1% 琼脂糖凝胶电泳检测提取的线粒体DNA。DNA 产物由上海生工生物工程有限公司代理测序，ABI 3730 PRISM DNA 测序仪产生ABI 文件。

1.2.3 数据分析方法

测序结果由Chromas 获得原始数据，产生清晰的序列图谱。用ClustalX 软件对测序结果进行同源序列比对，Dnasp4.10 用于遗传多样性分析。统计多态位点数、单倍型数、单倍型多样度、核苷酸多样度和平均核苷酸差异，用MEGA3.1 构建系统进化树。

单倍型多样度H 是指样本中随机抽取到的2个不同单倍型频率。单倍型多样度值（Haplotype diversity，Hd）和核苷酸多样度（Nucleotide diversity）的值（Pi）表示了群体mtDNA 变异程度。这2个值越大，群体的多态程度越高，遗传多样性越丰富［6］。

分别测量公驴和母驴的身高、体斜长、尻斜长、胸围和管围，并用SPSS（19.0）统计分析软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 PCR 扩增产物电泳检测PCR 扩增产物

用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1 所示，PCR 扩增产物条带单一、清晰，电泳片段大小与预期估计的片段大小相符，且符合测序要求。

图1 PCR 扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测的结果Fig.1 PCR amplification products were detected by 1%agarose gel electrophoresis

2.2 测序图谱

DNA 产物由上海生工生物工程有限公司代理测序，ABI 3730 PRISM DNA 测序仪产生的文件经软件Chromos 分析，产生清晰的序列图谱（图2）。测序结果经过校正后，与发表在GenBank 上的欧洲家驴线粒体全序列（序列号：X97337）进行序列对比，证明本试验扩增和测序的片段是驴线粒体DNA D-loop 区部分序列，满足进一步研究要求。

图2 由ABI 3730 PRISM DNA 测序仪产生的序列文件Fig.2 Sequence files generated by the ABI 3730 PRISM DNA sequencer

2.3 不同碱基含量与遗传多样性分析

家驴mtDNA 基因组总长度16 670 bp，其中D-loop 区的总长度为 1 207 bp，GenBank 的登录号为X97337。本研究对晋南驴99 个样本的mtDNA D-loop 部分序列进行测序，长度共为480 bp。以X97337 为对照，研究所测得序列核苷酸位置介于15 485～15 785（D-loop 序列 22～322）和 15 946～16 126（D-loop 序列 483～663）之间，利用 ClustalX软件进行序列比对，结果显示：99 个序列4 个核苷酸 A、C、T、G 的含量分别为 29.8%、14.2%、30.3%、25.6%，全部碱基中G+C 含量为39.8%，A+T 含量为60.2%，其中57 个位点发生转换，40个位点发生颠换。用Dnasp4.10 进行遗传多样性分析，结果表明：本研究测定晋南驴群的单倍型多样度、核苷酸多样度和碱基对平均差异数分别为0.867±0.034、0.0270 7、9.640（表 1），表明晋南驴品种具有丰富的遗传多样性。

2.4 核苷酸变异位点分析

利用软件Dnasp4.10 分析中国晋南驴99 个个体mtDNA D-loop 480 bp。结果表明，除去缺失位点，共检测到多态位点97 个，占总数的20.21%。在所有单倍型中，只有一个单倍型出现变化的位点为单一多态位点；有2 个单倍型分别出现不同的位点称之为三碱基的单一多态位点；有2 个以上单倍型出现一种变化的称为两碱基的简约信息位点；在同一位点有2 种不同的变化且每种变化都含有2 个以上的单倍型的位点称为三碱基简约信息位点。本研究共发现单一多态位点为56 个，占总位点的11.67%。简约信息位点为41 个，占总分析位点的8.54%。其中两碱基单一多态位点（two variants＞）52 个碱基位置分别为：76、77、78、83、86、88、105、121、142、153、179、187、188、192、193、203、208、209、212、213、215、216、219、221、223、224、229、231、232、233、234、236、238、241、242、243、246、248、249、252、257、259、262、265、266、267、274、285、288、312、509、528。两碱基简约信息位点 30 个，碱基位置分别为：74、80、81、82、93、106、111、112、115、129、130、137、138、162、163、181、185、205、217、226、284、297、298、512、529、587、593、613、614、635。 三 碱基单 一 多 态 位点（there variants＞）4 个碱基位置分别为：79、87、90、227。三碱基简约信息位点9 个碱基位置分别为：84、96、99、101、145、186、204、225、256。四碱基简约信息位点2 个，碱基位置分别为：97、98。

表1 晋南驴遗传多样指数Table 1 Genetic diversity index of Jinnan donkey

2.5 单倍型及单倍型分析

经分析中国晋南驴99 个个体mtDNA D-loop，共定义出 54 个单倍型（Haplotype）（表 2）。

在 54 种单倍型 99 个个体中，Hap_35 出现频率最高为36.36%，包含了36 个个体，其余单倍体均包含1～3 个个体（表2）。这个结果表明，单倍体Hap_35 为优势单倍体。

表2 晋南驴mtDNAD-loop 54 种单倍型的多态位点Table 2 Polymorphic loci of 54 haplotypes in mtDNA D-loop of Jinnan donkey

2.6 体型统计分析

分别对18 头公驴和75 头母驴进行描述性统计，成年公驴的身高、体长、胸围和管围（均数±标准 差）分 别 为（130.61±4.6）cm、（122.0±5.6）cm、（146.2±6.7）cm 和（15.78±0.81）cm；成年母驴的身高、体长、胸围和管围（数据±标准差）分别为（126.4±6.7）cm、（120.6±7.3）cm、（145.3±7.7）cm 和（15.84±0.7）cm。体型符合吕效吾在山西省家畜家禽品种志中列出的大型驴种标准，晋南驴属于大型驴种（表3、表4）［7］。

将本研究18 头公驴和75 头母驴的体型数据与吕效吾的山西省家畜家禽品种志中377 头公驴和 720 头母驴的测量数据进行 F、t 检验［7］。研究结果表明此次晋南驴群测定结果在身高、体长和管围等体型性状上与之相比没有显著性差异，但胸围与之相比差异显著，有增加趋势（表5、表6）。

表3 公驴测定性状的描述性统计Table 3 Descriptive statistics of male donkeys

表4 母驴测定性状的描述性统计Table 4 Descriptive statistics of female donkeys

表5 样本组与对照组（公驴）体型的F、t 检验结果Table 5 Statistic analysis results of F and t test of control and sample groups（male）

表6 样本组与对照组（母驴）体型差异的F、t 检验结果Table 6 Statistic analysis results of F and t test of control and sample groups（female）

研究进一步对试验测量得到的18 头公驴和75头母驴的身高、体长、胸围和管围进行F 和t 检验，对比数据结果，公母两种性别的驴在体长、胸围和管围上没有显著性差异，且公驴的身高高于母驴（表7）。

2.7 构建系统发育树及亲缘关系分析

从GenBank 中引用已经递交的欧洲家驴线粒体基因组全序列（登录号为X97337），与本研究测得的晋南驴99 个个体组成的54 个单倍型（标号分别为）共 55 个序列，采用 N-J（Neighbor Jioning）法，由MEGA3.1 软件构建系统发育树，设定为Kimura 两参数法，重复次数 1 000 次（图 3）。该群体的亲缘关系主要分为两支，其中一支与X97337（欧洲家驴）聚在一起，表明晋南驴群体在亲缘关系上有一定的分化，群体有一定的混杂。

对晋南驴群体中的18 头公驴构建系统发育树，采用 N-J（Neighbor Jioning）法，由 MEGA3.1软件构建，设定为Kimura 两参数法，重复次数1 000 次（图4）。结果表明公驴的亲缘关系也分为两支，证明晋南驴群体在亲缘关系上有一定分化。

表7 晋南公母驴体型差异F、t 检验结果Table 7 Statistic analysis results of body phenotype F and t test of male and female donkeys

图3 晋南驴54 个单倍型和GenBank 中欧洲驴构建的NJ系统发育树Fig.3 NJ phylogenetic tree of Jinnan 54 haplotypes of donkey constructed with European donkey from Gen-Bank

图4 晋南驴18 个雄性个体的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of 18 male individuals of JinNan donkey

3 讨论与结论

3.1 晋南驴mtDNA D-loop 区的遗传多样性

哺乳动物的线粒体碱基替换存在转换偏倚现象，且随着进化时间增加，转换偏倚下降。本研究结果与朱文进、高雪等［8，9］对中国家驴品种研究结果相符，没有发生序列长度变异，核苷酸变异发生转换的频率高于颠换。本研究发现晋南驴mtDNA D-loop 区的变异除去缺失和插入的位点，包括了57 处碱基转换和40 处碱基颠换，转换和颠换之比为1.43。这表明晋南驴的mtDNA 在这一区域有着较高的转换和颠换。

晋南驴群体中共检测到核苷酸多态位点97个，多态位点比例为20.21%；核苷酸多样度0.027 07；54 种单倍型，单倍型比例为 54.55%，其中Hap_35 出现频率最高为36.36%，包含了36 个个体，单倍体Hap_35 为优势单倍体。单倍型多样度为0.867±0.034。表明晋南驴的遗传多样性较为丰富，但种群有一定混杂，亲缘关系有一定的分化。Ivankovic［10］对 克 罗 地 亚 的 3 个驴群体 28 个个体mtDNA D-loop 区的一段391 bp 序列进行分析，检测到36 个核苷酸多态位点，多态位点比例为9.21%。其中碱基替换34 个，占94.44%，2 个插入位点，占5.56%。杨东英［11］对2 个品系德州驴（三粉驴和乌头驴）的线粒体DNA D-loop 区399 bp 的碱基序列进行分析，检测出核苷酸多态位点24 个，多态位点比例为6.02%。赵朝霞［12］分析中国的6 个家驴品种（关中驴、德州驴、庆阳驴、泌阳驴、广灵驴、晋南驴）mtDNA D-Loop 部分序列的遗传多样性，单倍型多样度以关中驴、晋南驴较高，分别为 0.834 和0.904；其次为泌阳驴和广灵驴，分别为0.629、0.529；德州驴和庆阳驴较低，分别为 0.467、0.599。而雷初朝［13］的研究发现关中驴的D-loop 区核苷酸变异只有转换1 种形式，6 头关中驴D-loop 区的核苷酸序列组成3 种单倍型，单倍型比例为50.00%。对比以上这些研究，本次测定的晋南驴DNA D-loop 区部分发现了较多的SNP 多态性位点，这一结果与我们所用的晋南驴群体样本量较大有一定的关系，同时也表明该试验群体中的驴来源较为广泛。

3.2 晋南驴体型变化

自1979 年山西省开展的畜禽品种资源调查后，多年没有对晋南驴开展规模化的体型测定工作。本文对晋南驴群中18 头公驴和75 头母驴的4个体型性状：身高、体长、胸围和管围进行测定，结果表明此次研究的晋南驴群的体型符合山西省家畜家禽品种志的大型驴种标准，属于大型驴种。将本次体型测定与吕效吾在山西省家畜家禽品种志中列出的晋南驴377 头公驴和720 头母驴的体型测定数据进行对比发现，晋南驴在身高、体长和管围等体型性状上与40 年前的测定结果一致，无显著差异，但胸围与之相比有增加趋势且二者之间差异显著，可能的原因是过去驴作为农业耕作和运输工具，不需要经过育肥期，所以胸围较小；而现在驴主要是作为肉用动物，需要经过10 个月的育肥期，并且驴的运动量大大减少，所以造成驴的胸围有增大趋势。

3.3 系统进化树及亲缘关系

晋南驴试验群体中的18 头公驴分别来自曲沃、侯马、夏县、闻喜等地，结合其产地及遗传距离（图4），可将其分为9 个家系，再按照晋南驴体格高大，头部清秀，背腰平直、黑色带“三白”的特征选择良种，为晋南驴的品种保护工作提供依据与方向。

在分子水平上本文证明了晋南驴具有较为丰富的遗传多样性，并以此为依据判断了晋南驴的亲缘关系以促进品种保护工作的开展，但要进一步研究晋南驴的遗传多样性，还需要开展多种类型的遗传分析以获得更多的遗传学证据。

晋南驴mtDNA D-Loop 区的序列分析显示该群体在亲缘关系上主要分为2 支，表明该晋南驴群体中来源不同的个体在亲缘关系上有一定的分化。基于此次研究的结果，我们认为晋南驴群体在一定程度上已与其它驴种有所混杂，急需开展相应的保种工作。