栽培黑果枸杞活性成分生物合成关键基因克隆及表达分析

王德富，杨锋，崔丽艳，龙丹丹，李玲玉，申少斐，牛颜冰

（山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）

黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）为茄科（Solanaceae）枸杞属（LyciumL.）多年生灌木植物，野生资源多分布于我国新疆、西藏、青海等地，具有防风固沙和改善土壤盐碱度等作用［1］。研究表明，黑果枸杞中富含的花色苷和原花青素具有清除自由基、改善心热、月经不调等功效［2，3］，常被广泛用作食品、药品和保健品添加剂。随着药用价值的不断挖掘和开发，野生黑果枸杞种群数量骤减。尽管近几年山西、内蒙古等地有人工引种和栽培，但人工栽培黑果枸杞花色苷和原花青素含量的动态变化规律以及调控二者产生的关键酶基因表达模式尚不清楚。探究人工栽培黑果枸杞中花色苷和原花青素的积累水平和合成规律，进而确定其最佳采收期，为农业生产提供一定的科学依据。同时关键调控酶基因的克隆为利用基因工程技术进行黑果枸杞靶向育种，促进花色苷和原花青素含量的积累奠定基础，对于果实品质的改良具有重要的理论和实践意义。黄酮类化合物的合成途径是目前研究较清楚的代谢途径，而花色苷与原花青素的上游合成途径与黄酮基本相同，都以苯丙氨酸和络氨酸为底物，先经多种酶催化形成二氢黄酮醇中间产物，随后在花青素合成酶（ANS）等催化形成花色苷［4］，而无色花色素则在无色花色素还原酶（LAR）催化下形成2，3-反式黄烷-3-醇单体，花色素在花色素还原酶（ANR）催化下形成2，3-顺式黄烷-3-醇单体，二者相互协调控制原花青素的产生和积累［5］。研究表明，通过药材的活性成分含量测定以及成分代谢途径中合成酶基因的表达分析可有效判定药材的采收期［6，7］。陈娟等［8］对不同生长期的穿心莲活性成分及关键酶ent-柯巴基焦磷酸合酶（CPS）基因表达情况进行分析，发现穿心莲的最佳采收期为始花期。目前人工栽培黑果枸杞的最佳采收期和活性成分积累规律尚不清楚，本研究期望从分子水平揭示其有效成分含量动态积累规律和关键调控基因表达模式，进而确定果实最佳采收期。

1 材料和方法

1.1 试验材料

4 个不同发育时期的黑果枸杞果实样品（图1）采自山西省忻州市静乐县，放入液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，备用。

图1 黑果枸杞不同生长时期果实样品Fig.1 Images of L. ruthenicum fruits at different developmental stages

1.2 试验方法

1.2.1 花色苷和原花青素的提取及含量测定

参考Liao 等［9］的方法进行黑果枸杞果实不同时期花色苷含量测定和提取，参考Liu 等［10］的方法进行原花青素提取和含量测定，以儿茶素为标准物质衡量黑果枸杞中原花青素的含量，每次试验至少3 次生物学重复。

1.2.2 关键酶基因的克隆和表达分析

采用Troizl 法提取总RNA，进一步反转录形成 cDNA，针对DFR、ANS、LAR和ANR4 个关键酶基因设计特异性引物进行PCR 扩增，扩增产物回收后与 pMD18-T 载体连接、转化 DH5α 感受态细胞，阳性克隆送至测序。Real-Time PCR 反应体系及程序参照说明书进行，并以各个时期黑果枸杞样品的 18S rRNA 为内参基因，根据 2-ΔΔCt法计算4 个基因的相对表达量。所使用引物序列见表1。

1.2.3 生物信息学分析

利用GenBank Blast 工具进行序列检索；采用DNAstar 软件进行序列拼接；用DNAMAN 软件进行序列相似性分析；用ORF finder 在线预测氨基酸序列；用 ProtParam（http：//www. expasy. org/tools/）工具进行等电点和理论分子量预测；用MEGA 7 软件构建氨基酸序列系统进化树。

2 结果与分析

2.1 黑果枸杞生长过程中花色苷和原花青素代谢量变化分析

不同生长时期黑果枸杞花色苷含量变化如图2A 所示，随着果实成熟度不断增加，花色苷含量呈逐渐上升趋势，S4 期含量最高达到6.08 mg·g-1DW。原花青素含量变化如图2B 所示，从S1～S3期，PAs 含量呈逐渐上升趋势，S3 期达到峰值，为22.3 mg·g-1DW，随后到 S4 期时，PAs 含量有所下降，但仍高于S1 和S2，说明S3 期为原花青素的最大积累期。

2.2 LrDFR、LrANS、LrLAR 和 LrANR 基因克隆及序列分析

利用已设计的特异引物（表1）对4 种关键酶基因进行PCR 扩增，测序后分别获得大小为1 140 bp、1 251 bp、1 002 bp 和 1 017 bp 的 DNA 序列，分别编码大小为 379、416、333 和 338 aa 的蛋白质。蛋白质分析表明4 种编码蛋白的分子量/等电点分别为 42.3 KDa/6.15、46.6 KDa/5.55、37.5 KDa/6.26 和36.7 KDa/6.33。氨基酸序列分析表明LrDFR 与其他植物DFR 存在高度保守的NADPH基序，但22 位的Ala 与部分物种的Ser 存在差异（图 3）；LrANS 与其他植物 ANS 均存在 DIOX_N和2OG-Fe Ⅱ_Oxy 两个保守结构域，且组氨酸（His，H）、精氨酸（Arg，R）、天冬氨酸（Asp，D）和谷氨酸（Glu，E）残基在 2OG-FeⅡ_Oxy 结构域高度保守（图 4）；LrLAR 与其他植物 LAR 存在 3 个保守结构域，分别是RFLP、ICCN 和THD，但也存在部分差异（图 5）；LrANR 与其他植物 ANR 也存在高度保守的NADPH 基序（图6）。

表1 引物序列Table 1 The Primer sequences

图2 黑果枸杞果实花色苷（A）和原花青素（B）代谢量变化情况Fig.2 The metabolism of anthocyanins（A）and proanthocyandins（B）in L.ruthenicum at different growth stages.

2.3 LrDFR、LrANS、LrLAR 和 LrANR 系统进化分析

将4 个关键酶基因所编码的蛋白序列分别与不同物种蛋白序列构建系统进化树，分析发现DFR 进化株系可分为3 大类，第一类包括红薯（Actinidia chinensi）、紫苏（Perilla frutescens）、猕猴桃（Actinidia chinensi）以及茄科的烟草（Nicotiana tabacum）等，其中LrDFR 与宁夏枸杞DFR 同属一个分支；第二类包括芍药（Paeonia lactiflora）和蔷薇科的草莓（Fragaria x ananassa）、玫瑰（Rosa chi-nensis）等，第三类为小麦（Triticum aestivum）和棕榈（Elaeis guineensis），同 LrDFR 的亲缘关系最远（图7A）；ANS 株系进化关系可分为4 大类，其中LrANS 与茄科植物ANS 和红薯聚为第二大类，亲缘关系较近（图7B）；LrLAR 与马铃薯聚为一个小分支，亲缘关系最近，与不同品种的烟草亲缘关系次之，同聚为第二大类（图7C）；ANR 的进化株系与 ANS 相似，也被分为 4 类，其中 LrANR 与茄科植物亲缘关系最近，聚为第三大类（图7D）。

图3 不同物种DFR 编码氨基酸序列比较Fig.3 Comparison of amino acid sequences encoded by DFR from different species

图4 不同物种ANS 蛋白的2OG-FeⅡ_Oxy 功能域序列比对分析Fig.4 Comparative analysis of 2OG-FeⅡ_Oxy domain of ANS protein from different species

2.4 4 种关键酶基因的表达模式分析

不同生长时期4 个关键酶基因的表达趋势如图8 所示，LrDFR与LrANS的表达模式基本相似，随着果实不断发育成熟，表达量也逐渐提高，其中LrANS在 Stage 4 时，表达量可达到 1.0，Lr-LAR和LrANR的表达模式也比较类似，均为先上升后下降，在Stage 2 时表达量均达到最高，但Lr-LAR的变化幅度较大，在Stage 3 时表达量大幅度降低，Stage 4 时几乎不表达。

3 讨论与结论

图5 不同物种LAR 蛋白的结构域序列比对分析Fig.5 Sequence alignment of LAR protein structural domain from different species

图6 不同物种ANR 蛋白的氨基酸序列对比分析Fig.6 The comparative analysis of structural domain sequence among different ANR proteins

花色苷作为一大类水溶性颜料，在野生黑果枸杞含量极其丰富，而且它的积累量与变化直接参与果实表观颜色的形成，甚至决定产品的质量。本试验利用pH 示差法对采自静乐县的人工栽培黑果枸杞成熟果实花色苷进行测定，其含量高达6.08 mg·g-1DW，同时利用香草醛-浓盐酸检测到成熟果实中原花青素含量为22.3 mg·g-1DW，该实验结果分别与楼舒婷［11］和段雅彬等［12］的报道结果一致，说明人工栽培黑果枸杞可作为花色苷提取的重要原料。同时发现随着花色苷的不断积累，黑果枸杞果实颜色也在逐渐加深，且ANS 的表达量也随之增加，这种变化模式与在草莓（Fragaria ananassaDuch.）［13］、黑 莓（Rubus fruticosusL.）［14］等植物中所体现出的趋势相一致。在原花青素的积累规律上，发现其含量总体变化为上升趋势，但后期若果实过度成熟，其含量反而有所下降，这种变化模式与毛果（Populus trichocarpa）叶片中原花青素含量变化趋势相一致［15］。因原花青素具有预防癌症和心血管疾病等功效，生产中为避免果实过度成熟而影响其提取效率，在实际操作过程中建议在S3 期采收。

图7 基于4 种关键酶基因所编码氨基酸序列的系统进化分析Fig.7 Systematic evolution analysis of amino acid sequence encoded by four key enzyme genes

许多植物果实形成和成熟过程中，花青素积累受到多种转录因子的共同调控，常被看作是监测果实成熟度和感官品质的有效标志物［16］。Fang等［17］对李子（Prunus salicinaLindl.）的成熟过程进行研究，发现果实颜色由绿变红与花青素的明显增加成正相关，同样的现象在苹果（Malus pumilaMill.）［18］，葡萄（Vitis viniferaLinn.）［19］，草莓［20］，茄子（Solanum melongenaLinn.）［21］和 荔 枝（Litchi chinensisSonn.）［22］中均有发现。本试验对黑果枸杞不同生长时期中花青素积累水平进行分析，发现随着果实颜色逐渐变深，其花青素含量也呈逐渐上升趋势。同时发现在果实生长前期，LrLAR表达量高于LrANR，而LrANR 表达量低的原因可能是由于LrANR 途径在果实生长前期缺乏花色素前体物质所致，具体原因还需进一步研究。

图8 不同生长时期4 个关键酶基因的表达分析Fig.8 Expression analysis of four key enzyme genes at different growth stages

花色苷的生物合成是在11 种关键酶的多步催化下完成［17，23］，而且该合成通路在许多植物中得到广泛研究，相关结构基因也已鉴定，包括拟南芥（Arabidopsis thaliana）［24］、苹 果（Malus pumilaMill.）［25］、茄 子（Solanum melongenaLinn.）［26］、瓜叶菊（Pericallis hybridaB. Nord.）［27］和樱桃（Cerasus pseudocerasus（Lindl.）G. Don）［28］。 本 研 究从栽培黑果枸杞成熟果实中克隆得到的4 种关键酶基因在花色苷和原花青素生物合成中同样起到关键调控作用，分别对其编码蛋白结构域进行分析，发现LrDFR 与宁夏枸杞和猕猴桃DFR 位点序列一致，都存在保守的 NADP 结合位点［29］，且其底物 特 异 结 合 位 点 均 为 Asp142［30］。 LrANS 存 在2OG-FeⅡ_Oxy 和 DIOX_N 两个保守功 能域，且都与 Fe2+的结合有关［31］，推测 LrANS 可能通过 2个酶活中心共同催化产生花青素。LrLAR 存在RFLP、ICCN 和 THD 3 个保守结构域，通过与其他已报道的ANS 序列比对，发现存在5 个差异性氨基酸位点，进一步通过SIFT 软件分析，发现这些氨基酸残基的变化不会对LrLAR 功能产生影响。LrANR 作为NADB-Rossmann 超家族成员，与葡萄 ANR 亲缘关系较近［32］，同时 LrANR 属于黄酮还原酶 SDR 超家族，具有 SDR 家族特征［33］，与葡萄VvANR 催化位点一致［34］。控制花色苷合成的结构基因转录水平受转录因子的调控，包括MYB（Myeloblastosis）、bHLH（Helix-loop-helix）和 WD40 家 族［35，36］。 ZmC1（Zinc metallochaperone-1）作为植物中第一个被报道的MYB 转录因子，在玉米花青素生物合成中起关键调控作用［37］，Schwinn 等［38］研究发现 R2R3-MYB 基因决定植物中花青素的时空表达模式，而本研究克隆得到的4种关键酶基因具体受哪一类转录因子的调控目前尚不清楚，亟待进一步深入研究，为后续进行基因工程改造和靶向育种试验奠定基础。