不同倍性葡萄种质激素水平比较分析

赵旗峰 ，马小河 ，黄丽萍 ，王敏 ，刘晓婷 ，王芸芸 ，谭伟

（1.山西省农业科学院果树研究所，山西太原，030031；2.果树种质创制与利用山西省重点实验室，山西太原，030031；3.枣庄学院食品科学与制药工程学院，山东枣庄277160）

具有3 套或者3 套以上完整染色体组的生物个体、居群或种称为多倍体，多倍体植株通常表现为生长旺盛、枝粗、叶厚、果大、产量高及适应性强等特点，因此，多倍体育种日渐成为培育果树新品种的重要途径［1］。应用秋水仙素诱导葡萄多倍体是国内外育种者获得多倍体的主要方式之一［2～9］，国内育种者2000 年之后通过秋水仙素诱变，培育出2 个三倍体无核葡萄品种——‘无核早红’［10］、‘红标无核’［11］，5 个四倍体葡萄品种——‘巨峰玫瑰’［8］、‘早黑 宝 ’［12］、‘ 秋黑宝’［13］、‘晚 黑 宝 ’［14］、‘玫香宝’［15］，四倍体葡萄由于其粒大籽少、产量高等特点倍受育种者和消费者的青睐。

多倍体相对于其同源二倍体在遗传及表型上有很大的优势。一般认为，植物营养器官性状的变化与基因的剂量有关，随着基因拷贝数的增加，基因转录产物量的变化，植物的一些性状也发生相应变化［16］。四倍体葡萄比二倍体的叶片大而厚，叶柄和枝条粗壮，果粒、花粉粒都大［17］。植物激素作为一类植物自身产生的有机物质，能够协同调控植物的生长、发育与分化。目前关于多倍体植株，尤其是木本植物内源激素的报道尚不多见。一般认为，随着染色体倍数的增加，部分植物内源激素的含量会有所上升，而上升的比例与染色体增加的倍数并无多大关联［18～20］。但也有报道发现，有时内源激素也会随着染色体倍数的增加而降低［20，21］。关于多倍体葡萄与二倍体植株内源激素含量的差异少见报道。因此，本文选取与生长发育最相关的几种激素进行研究，试图从激素水平上分析四倍体品种在栽培上表现的生根难、根系少、早衰等问题。本研究中以3 组同基因型不同倍性的葡萄品种为试材，对其生长发育过程中新梢和根系3 种常见内源激素（吲哚乙酸（IAA）、脱落酸（ABA）和细胞分裂素（CTK））含量进行测定，旨在为四倍体育种以及栽培生理的研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验选取3 对种质材料，分别为二倍体玫瑰香（玫瑰香）和四倍体玫瑰香、二倍体红地球（红地球）和四倍体红地球、2-2-2（2-2 的二倍体）和2-2-4（2-2 的四倍体）。

试验采集6 份种质材料的葡萄枝条，分别为‘玫瑰香 ’、‘四倍体玫瑰香’、‘红地球’、‘四倍体红地球’、‘2-2-2’、‘2-2-4’。用营养袋苗扦插繁育，待葡萄苗长到5～6 片叶时，取新梢和新根，液氮冷冻-80℃冰箱保存备用，每处理3 次重复。

1.2 试验方法

参照 Chen［22］和 Gou 等［23］的方法，取植物样品约0.5 g（精确到0.0001），液氮中研磨，加氘代内标后80%甲醇浸提过夜，离心沉淀去上清液，残渣用甲醇浸提一次。提取液减压去甲醇至水相，调pH 至3.0 后用等体积乙酸乙酯萃取上次合并。调pH 至8.5 后用磷酸缓冲液萃取。水相再调pH 至3.0 后用乙酸乙酯萃取。去有机相后经C18 Sep-Pak 和MCX（Waters，USA）进一步纯化。洗脱液减压浓缩至干后用用HPLC 起始液溶解。

植物激素经HPLC 多阶质谱（LCQ Deca MAX，HPLC-ESI-MS，Thermo-Finnigan，USA）检测分析。C18 柱（2.5 mm × 150 mm，3.5μm（Angilent，USA）HPLC 分离、驳接离子阱质谱分析器（LCQ，Thermo-Finnigan，USA）。HPLC 流动相由甲醇和水组成，线性梯度洗脱。质谱检测为二级裂解离子全扫描模式采集数据，后续定量分析采用选择离子检测方式选定各激素裂解后的特征碎片离子。质-质数据处理与分析用Xcalibur 2.1 数据处理软件分析（Thermo-Finnigan）。

1.3 统计分析

取3 次重复平均值作为激素含量。应用SPSS13.0 和Excel 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同倍性葡萄品种表型特征比较

从图1～图3 可以看出，所有参试的葡萄种质材料四倍体与其二倍体相比，在花序、花蕾、卷须、梢尖、新梢、叶片等形态方面均表现出巨大的差异性。

2.2 不同倍性葡萄种质新梢叶片和根系中IAA含量的比较

由图4 可见，四倍体葡萄新梢叶片中IAA 含量均显著低于相应的二倍体葡萄，‘四倍体红地球’、‘2-2-4’和‘四倍体玫瑰香’分别为二倍体葡萄的41.0%、77.9%、38.2%。

‘四倍体红地球’葡萄根系中IAA 含量显著高于二倍体‘红地球’葡萄，是‘红地球’的1.22 倍。‘2-2-4’和‘四倍体玫瑰香’分别为二倍体葡萄的1.10、0.92倍，与二倍体含量差异不显著。

2.3 不同倍性葡萄种质新梢叶片和根系中ABA含量的比较

由表1 可见，四倍体葡萄新梢叶片中trans-ABA（t-ABA）和cis-ABA（c-ABA）含量均显著低于相应的二倍体葡萄，‘四倍体红地球’、‘2-2-4’和‘四倍体玫瑰香’t-ABA 含量分别为二倍体葡萄的 31.0%、60.5、23.6%，c-ABA 含量分别为二倍体葡萄的40.5%、74.8%、80.0%。

‘四倍体红地球’和‘2-2-4’葡萄根系中t-ABA 含量稍低于二倍体葡萄，但是差异不显著，而‘四倍体玫瑰香’根系中t-ABA 含量显著低于二倍体‘玫瑰香’；‘四倍体红地球’根系中c-ABA 含量是‘红地球’的 1.51 倍，‘2-2-4’葡萄根系中 c-ABA 含量较‘2-2-2’低21.4%，但差异不显著。‘四倍体玫瑰香’显著低于‘玫瑰香’，为‘玫瑰香’的70.0%。

2.4 不同倍性葡萄种质新梢叶片和根系中CTK含量的比较

图1 红地球二倍体、四倍体表型性状Fig.1 Phenotypic characteristics of"hongdiqiu"diploid and tetraploid

图2 玫瑰香二倍体、四倍体表型性状Fig.2 Phenotypic characteristics of"meiguixiang"hamburg diploid and tetraploid

由表2 可见，6 份材料中仅‘红地球’和‘四倍体玫瑰香’叶片中检测到iP9G，但含量均低于0.010 ng·g-1FW。除 iP9G 外的 9 种细胞分裂素，‘四倍体红地球’叶片中含量均高于‘红地球’，其中两者叶片中ZOG、DZR 和iP 含量无显著差异，两者其余6种细胞分裂素含量差异显著，为‘红地球’的1.36～3.99 倍；而‘2-2-4’叶片中含量均低于‘2-2-2’，其中除Z7G 外的8 种细胞分裂素含量均显著低于‘2-2-2’，为‘2-2-2’的 12.7%～68.6%；‘四倍体玫瑰香’叶片中Z7G 和DZR 含量均高于‘玫瑰香’，其中 DZR 含量比‘玫瑰香’高 48.7%（p＜0.05），而其余7 种细胞分裂素含量显著低于‘玫瑰香’，为‘玫瑰香’的35.7%～82.4%。

图3 2-2 二倍体、四倍体表型性状Fig.3 Phenotypic characteristics of 2-2 diploid and tetraploid

图4 不同倍性葡萄种质新梢叶片和根系中IAA 含量Fig.4 IAA contents in fresh leaves and roots of different ploidy grape germplasm

由表3 可见，根系中10 种细胞分裂素，6 份材料中均未检测到 Z7G，仅‘红地球’、‘2-2-2’和‘四倍体玫瑰香’检测到iP9G，含量均低于0.010 ng·g-1FW；‘四倍体红地球’根系中未检测到DHZ9G和iP9G，‘红地球’根系中未检测到ZROG，‘四倍体红地球’和‘红地球’根系中Z9G 含量无显著差异，其余5 种细胞分裂素均表现为‘四倍体红地球’显著低于‘红地球’。‘2-2-4’和‘2-2-2’根系中Z9G、ZROG、DHZ9G 含量均无显著差异，‘2-2-4’ZOG 和 DHZR 含量显著高于‘2-2-2’，为后者的1.26、3.82 倍，ZR、iP 和 iPR 含量则显著低于‘2-2-2’。‘玫瑰香’根系中未检测到Z9G，‘四倍体玫瑰香’中未检测到ZROG、DHZ9G，‘四倍体玫瑰香’中 ZOG 含量显著高于‘玫瑰香’，而ZR、DHZR、iP和iPR4 种细胞分裂素则显著低于‘玫瑰香’。

表2 不同倍性葡萄种质新梢叶片中细胞分裂素含量Table 2 The content of different kinds of Cytokinins in fresh leaves of different ploidy grape germplasm

表3 不同倍性葡萄种质根系中细胞分裂素含量Table 3 The content of different kinds of Cytokinins in roots of different ploidy grape germplasm

3 讨论

植物器官的大小受严格的遗传控制，相关基因的过量表达或不表达可以改变植物器官大小。受等位基因含量效应、转录因子数量和遗传的影响，某些基因的表达在同一物种不同倍性之间存在一定的差异，这可能也解释了倍性的增加对不同激素造成的差异不同的原因。本研究结果表明不同葡萄品种叶片和根系中IAA、ABA、CTK 含量均受到倍性的影响。

生长素的生理作用之一是促进叶片扩大，抑制根的生长；脱落酸主要生理功能之一则是抑制植株生长，主要抑制胚芽鞘、胚轴、嫩枝、根等器官的伸长生长过程。本研究中四倍体葡萄叶片中IAA、ABA 含量均显著低于相应的二倍体，IAA 浓度低时产生效应，高浓度时产生抑制；同时ABA含量降低。四倍体葡萄叶片比二倍体叶片大的主要原因可能与IAA、ABA 含量的降低有关。这一结论和前人的研究结果相符。

细胞分裂素的生理作用之一是促进细胞质分裂，使细胞体积增大。四倍体红地球和四倍体玫瑰香叶片中细胞分裂素含量显著高于二倍体红地球，说明细胞分裂素含量增加可能促进了四倍体红地球和四倍体玫瑰香叶片细胞体积增大。而2-2-4 中细胞分裂素含量均显著低于2-2-2，分析其原因可能由于该品种为嵌合体导致。

本文结果表明根系中四倍体中IAA 含量高于二倍体；而四倍体中的CTK 显著低于二倍体，所以CTK/IAA 的值四倍体显著小于二倍体。该结果和前人的CTK/IAA 值越小越利于生根，值大利于芽的发育不相符。这可能是由于采样期植株根系不属于根原基诱导期和不定根发育期，其内源激素含量的高低无法说明生根难易的问题。且本研究中10 种CTK 有些含量四倍体高二倍体，有些四倍体低于二倍体，无法明确的判断某一种CTK或几种在生根中起主导作用，这还需进一步研究。

植物激素在体内合成运往作用部位，在同样的生长环境下，多倍体葡萄根系中生长素含量高于叶片，说明其根系对环境敏感，抗逆性高于同源二倍体。根系中脱落酸在不同倍性间中含量较低，差异较小，可能倍性增加对根系中脱落酸含量的影响较小。王遂等［19］研究表明三、四倍体白桦叶芽中IAA 的含量明显高于二倍体，而ABA 含量低于二倍体，转录组数据说明在IAA 合成途径中，四倍体与二倍体相比共有11 个差异基因，全部上调表达，从分子角度初步阐释了多倍体白桦IAA含量上升的机理。多倍体西瓜果实发育过程中IAA 的含量大于其同源二倍体，而ZR、BR 在不同倍性西瓜果实发育过程中含量一直较低，且不同倍性间的差异较小。黄瓜属异源多倍体中的iPA和IAA 内源激素含量具有随着倍性的增加而降低。由于多倍体的复杂性，染色体倍数的增加与内源激素量的变化关系十分复杂，因此多角度对其进行研究阐述具有重要意义。

4 结论

四倍体葡萄叶片中IAA、ABA 含量低于二倍体。倍性的增加可能造成生长素、脱落酸的减少。四倍体根系中CTK 含量显著低于二倍体。该结论与前人研究结果相同。四倍体葡萄叶片比二倍体叶片大的主要原因可能与IAA、ABA 含量的降低有关。四倍体红地球和四倍体玫瑰香叶片中细胞分裂素含量显著高于二倍体红地球，说明细胞分裂素含量增加可能促进了四倍体红地球和四倍体玫瑰香叶片细胞体积增大。关于四倍体品种根系不发达，该研究结果表明四倍体根系中IAA 高于二倍体；而四倍体根系中CTK 显著低于二倍体，所以CTK/IAA 的值四倍体显著小于二倍体。该结果和前人研究结果CTK/IAA 值越小利于生根不符，同时本研究结论与栽培实践中出现的现象不符，有待进一步研究。