基于nrDNA-ITS 片段的16 份木耳属物种鉴定

刘虹 ，杨杰 ，郭丽杰 ，许晶 ，李素玲

（1.山西农业科学院食用菌研究所，山西太原030010；2.首都师范大学生命科学学院，北京100048）

木耳属Auricularia是一类重要的经济真菌，也是人类利用和栽培历史最为悠久的真菌类之一。木耳属是目前世界上仅次于蘑菇属Agaricus、香菇属Lentinus、平菇属Pleurotus的第四大人工种植的菌物类群［1］，是世界范围内人类重要的健康食物来源之一，在人们日常生活中占有不可或缺的位置［2，3］。同时，木耳也是近年来国内外持续研究最为热门的具有生物活性功能的菌物类群之一［4～9］。

木耳属最早建立于1780 年，Auricularia mesenterica（Dicks.：Fr.）Pers. 为其模式种，在自然界主要分布于热带、亚热带和温带，生长在各种阔叶树倒木或木桩上，是木腐菌的代表类群之一［10～12］。 真 菌 辞典第 十 版 记 载木耳 属 有 8 个物种［13］，新近的研究认为全世界有 10～15 种［14］。中国木耳属物种记录较多，中国食用菌名录中收录有 13 种［15］，新近的研究又增加了 3 种，即泰国木耳Auricularia thailandicaBandara & K.D. Hyde、小木耳A. minutissimaY. C. Dai，F. Wu & Malysheva 和西藏木耳A. tibeticaY.C. Dai& F.［16，17］。

山西有科学记录的木耳属物种有木耳A. auricula（L.）Underw.（=A. auricula-judae（Bull.）Quél.）、多毛木耳A. polytricha（Mont.）Sacc. 和皱木耳A. delicata（Fr.）Henn. 等 3 个物 种［18］。这些记录均源于形态学的鉴定，其引证标本也难以追踪（因存放上述标本的标本馆MHSU 的标本或已被转赠、或已损毁）。更重要的是在真菌系统分类学已经全面进入了分子时代的今天，野生木耳这一重要的资源在山西省尚缺乏分子数据的支持，这严重制约了这一重要资源的开发利用。与此同时，山西栽培的木耳名称过去一直沿用欧洲的A. auricula，而近来有研究显示这个欧洲物种其实在中国没有分布［17］，如果这个问题属实，那么山西种植的木耳属于哪个物种也是一个需要解决的问题。

为解决上述问题，笔者于2017—2019 年连续在山西各地代表性区域的森林中采集了多份野生木耳样本，同时在各地代表性的木耳种植基地采集样本。本研究共采集到16 份木耳属子实体样本，同时从GenBank 中下载了全球范围内的代表性可信度高的序列，采用nrDNA-ITS 片段分子比对和构建系统发育树并结合担子果的形态学特征进行物种鉴定，为山西木耳鉴定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 标本采集

本研究依据的样本为作者于2017-2019 年从中国山西各地森林中和代表性木耳种植基地采集的16 份木耳，所有样本采用组织分离法获得纯培养物。纯培养物经45℃烘干后，担子果标本保存于山西省农业科学院食用菌研究所（HSA）备用。

1.2 形态学观察

手持放大镜和体视显微镜下观察担子果的宏观形态学，以蒸馏水、3%KOH 作为浮载剂制作水封片在光学显微镜下观察担子果显微结构。

1.3 DNA 序列测定和系统发育树构建

新采集的山西木耳担子果标本的DNA 提取、PCR 以及序列测定参照 Fan 等［19］的方法，略作改进。担子果干标本总DNA 采用CTAB 法提取后，扩增核糖体DNA 内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）片段，PCR 扩增引物为 ITS1f/ITS4［20，21］，扩增条件为：94℃预变性 3 min，94℃变性 30 s，50℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，35 个循环，最后72℃延伸10 min。PCR 产物经纯化和测序（北京中科希林生工生物技术有限责任公司）获得的序列经手工校对后，于GenBank 进行比对（表1）。

系统发育树的构建和分析方法参照Fan 等［19］方法进行。将供试标本序列于GenBan 中进行Blast 比对，采用 Bandara 等［16，17，22］最近相关研究所使用的序列（表1）合并为数据集，以Exidia recisa和Exidiopsis sp. 为外类群，用EditSeq 软件将供试标本序列和从GenBank 下载的序列导成fas 格式文件，fas 文件采用Clustal X（Thompsonet al.1997）［23］软 件 进 行 序 列 比 对 ，接 着 用 Gblocks（http：//molevol. cmima. csic. es/castresana/Gblocks_server.html）在线剪切软件进行剪切并用Se-Al v.2.0（Rambaut 2000）［24］手工调整。以最大简 约 法（Maximum parsimony，MP）用 PAUP*4.0b10.（Swofford 2002）［25］构建 MP 树，具体参数设置为：Heuristicisearch→100random-addion sequence→TBR branch swapping→Bootsrap 1000 replication，分析检验各节点的置信度。用Tree-View32（Page 2001）［26］查看树的拓扑结构，支持值大于70（MPBS≥70%）视为可靠的支持值。

续表

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2 结果与分析

由图1 可见，本研究引证的16 份山西木耳属样本聚在了3 个不同的末端分支。其中，样本LH07 和 SL-04001 与短毛木耳A. villosulaMalysheva 的可信样本序列聚为一支，自举值为100%，且BLAST 显示其ITS 序列的相似度高达99%，结合担子果胶质柔软、子实层背面毛短等形态学特征的判断（表2），可以确定这2 份样本是短毛木耳A. villosula［17］。样本 LH13 和 SL-19，聚在A. cornea分支中，该分支得到到89%的自举值，结合其担子果质地坚韧、多毛的形态学特征分析，可以确定该样本为A. corneaEhrenb.［16，17］，其中 SL-19 是一个毛木耳白化栽培品种。LH544 等4 份野生样本和SL29 等8 份采自山西各地木耳种植基地的样本聚在含有来自黑木耳A. heimuerF. Wu，B.K.Cui & Y. C. Dai 模式标本序列的分支中，结合担子果胶质柔软、耳状、子实层背面毛少等特征，以及BLAST 结果（ITS 序列相似性为99%）可以确定这些样本为黑木耳A. heimuer［17，22］。

3 讨论

2014 年以前，几乎中国所有的相关文献都将中国栽培的黑木耳和形态学特征相似的野生样本定名为Auricularia auricula［11，15，26］。最新 的 研 究显示，Auricularia auricula是一个欧洲本地种，而中国广泛栽培和本土广布的形态相似物种是新近发表的黑木耳A. heimuer，一个亚洲本地物种［17，22］。刘波等［18］在《山西大型食用真菌》一书中记载了木耳A. auricula这个物种，但本研究没有分子数据支持这个欧洲物种在山西有分布，且形态学特征相似的样本全部聚在了亚洲本地种黑木耳A.heimuer下。结合欧洲木耳A. auricula这个物种尚未在欧洲以外地区发现这个事实，可以推定A.auricula在山西的记录可能是源于对黑木耳标本的错误鉴定，山西与A. auricula形态相似的木耳属物种应该是黑木耳A. heimuer，一个广布于中国并被广泛栽培的亚洲本地物种。

表2 引证样本形态特征一览表Table 2 The morphological features of the samples cited in this study

多毛木耳A. polytricha是另一个在山西记录有广泛分布的木耳属物种［18］。然而依据Index Fungorum 公 共 数 据 库 中 的 记 录 ，A. polytricha是黑色毛木耳A. nigricans（Sw.）Birkebak，Looney & Sánchez-García 的同物异名，而黑色毛木耳是一个美洲特有物种。本次研究仅在山西太行山地区采到一份毛木耳状的物种样本，但该样本的nrDNA-ITS 片段分析结果显示是毛木耳A. cornea（图1）。毛木耳A. cornea是一个形态上和黑色毛木耳相似的亚洲物种，广泛分布于中国和东南亚地区［16］。这些结果表明山西记录的多毛木耳A. polytricha可能也是源于对标本的错误鉴定，其正确名称应是毛木耳A. cornea。从生物地理学的角度分析，多毛木耳A. polytricha（=A. nigricans）在中国可能没有天然分布。

图1 基于nrDNA-ITS 片段的山西样本和相关物种的木耳属Auricularia 系统发育树Fig.1 Auricularia phylogenetic trees of Auricularia from Shanxi samples and related species based on nrDNA-ITS fragments

本研究没有发现刘波等［18］记录的皱木耳A.delicata（Mont. ex Fr.）Henn.。根据最近的一篇研究报告，皱木耳的形态种在系统发育分析中聚成2 个相互独立的分支，一个分支全部由澳大利亚样本的序列组成，另一个全部由南美洲样本的序列组成，均获得很高的自举值［16］。这个结果表明形态学特征下的A. delicata存在2 个隐存种（cryptic species），生物地理学上可能一个是澳大利亚本地种，另一个是南美洲的本地物种，考虑到山西有毛木耳分布，且皱木耳在形态学特征上有混淆毛木耳A. cornea的可能，因此在没有DNA 分子数据的情况下可能存在错误鉴定。解决这个问题还需要进行更多的样本的采集和研究。

4 结论

本研究结合形态学特征观察，依据nrDNAITS 片段分析，本研究在山西的16 份木耳样本中鉴定出的3 个木耳属物种，即黑木耳A. heimuer、短毛木耳A. villosula和毛木耳A. cornea，均为山西省新记录。其中8 份栽培的子实体柔软的褐色到黑褐色的木耳栽培样本均为黑木耳A. heimuer；一份在关帝山庞泉沟栽培的白色、质地硬脆、个体较大的木耳为毛木耳A. cornea的白化品种；仅有的2 份短毛木耳样本均来自野生样本，山西人工种植的木耳中没有发现这个物种。此前山西文献记录的木耳Auricularia auricula、多毛木耳A. polytricha和皱木耳A. delicata没有得到本研究的数据支持。山西境内多山，寒温带、温带、暖温带以及局部亚热带气候区域丰富多样，因此可以预测，未来随着样本量的增加，可能会有更多的木耳属物种被发现。