应激宁亚慢性毒性试验

1 材料与方法

1.1 受试药物

应激宁，批号：20190725，由武汉华扬动物药业有限责任公司提供。

1.2 实验动物

6周龄清洁级Wistar大鼠80只，雌雄各半，体重公鼠在130～150g之间，母鼠在120～140g之间，由扬州大学比较医学中心提供。动物生产许可证号：SCXK（苏）2012-0004，使用许可证号：SYXK（苏）2012-0029。

1.3 实验分组

将80只Wistar大鼠随机分为4组，分别为应激宁高、中、低剂量组和空白对照组，每组20只，雌雄各半。组内动物个体体重相差应不超过平均体重的20%，组间平均体重相差不超过5%。

1.4 给药剂量及给药途径

由于急毒试验没有测出LD50，90d喂养试验的高剂量组按最大耐受剂量10g/Kg（根据90d喂养试验指导原则确定为靶动物摄入量的100倍，靶动物推荐的摄入量为100mg/kg，试验大鼠即100mg/Kg×100=10g/Kg），混饲给药，分为低，中，高剂量组及对照组。给药各组剂量分别定为：0.0g/KgBW，2.5g/KgBW，5.0g/KgBW，10g/KgBW，连续给药90d。

期间受试药物给予量按大鼠每日饲料摄入量折算为饲料中受试药物浓度。因此在喂养试验的前30d大鼠每日饲料摄入按体重的10%折算，即将应激宁分别按2.5%、5.0%和10.0%的浓度添加于由比较医学中心提供的大鼠全价饲料的原粉料中，经充分混匀后热挤压制成颗粒料喂养。在喂养试验的后60d大鼠每日饲料摄入按体重的8%折算，即将应激宁分别按3.125%、6.25%和12.5%的浓度添加于大鼠全价饲料的原粉料中，经充分混匀后热挤压制成颗粒料供喂养。（注计算说明：高剂量组，大鼠1Kg的每日饲料摄入量为1,000g×10%＝100g，大鼠1Kg应给予的应激宁剂量为10g，即1Kg大鼠每日摄入的100g饲料中应添加应激宁10g。因此，折算成浓度百分比为10%，其他剂量类推。）

1.5 试验期间临床观察

服药期间每天肉眼观察大鼠的一般行为（包括精神状态，行为活动，采食量，饮水量，毛色，对外反应，粪便等）、中毒及死亡情况；同时记录饮水量、采食量，并按周测量大鼠体重，投入饲料量和剩余饲料量。并计算平均摄食量、增重。将染毒剂量组与对照组加以比较和统计学处理，及时记录和分析大鼠的中毒症状及出现各症状的先后次序、时间。

1.6 血液学和血液生化检测

在给药45d和90d结束时，各组随机抽取10只大鼠（雌、雄各半）采血进行血液学指标检测（包括血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数和分类等）和血液生化指标检测（包括谷草转氨酶（AST或SGOT）、谷丙转氨酶（ALT或SGPT）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、血糖（GLu）、血清白蛋白（Alb）、总蛋白（TP）、总胆固醇（TCH）和甘油三脂（TG）等）。

表1 对大鼠体重的影响（n=10）

1.7 病理检查

1.7.1 大体剖检

于给药45d和90d试验结束，各组分别取10只大鼠（雌、雄各半）进行剖检（可结合采血进行）。做好记录，并将重要器官和组织固定保存。

1.7.2 脏器称重

剖检试验大鼠的同时，称取大鼠体重及各主要脏器（包括肝、肺、心、肾、脾、胃肠、睾丸/子宫等）重量，计算各脏器系数。

1.7.3 组织病理学检查

对高剂量组及对照组大鼠的主要脏器进行组织病理学检查，发现病变后再对较低剂量组大鼠的相应器官及组织进行检查。

1.8 数据处理

2 结果

2.1 临床表现

各组大鼠拌饲给药直至90d，均无死亡，期间精神、活动，采食行为、饮水行为、毛色、对外反应和粪便等临床表现正常，没有出现病理状态和死亡。

2.2 对大鼠体重的影响

试验期间，每周对各组大鼠称重1次，统计周平均体重和周增重率。结果第1周高剂量组母鼠的周均增重率显著低于空白对照组（P＜0.05），其余各周各给药组母鼠的均重和周均增重率与空白对照组均无显著差异；第1～7周各给药组公鼠的均重都显著低于空白对照组（P＜0.05），第8～12周部分给药组公鼠的均重仍显著低于空白对照组（P＜0.05），但各给药组公鼠的周均增重率只有第1、2周显著低于空白对照组（P＜0.05），而第3周后各给药组公鼠的周均增重率与空白对照组均无显著差异，甚至有许多周还高于空白对照组的周均增重率，详细结果见表1。引起这现象的原因是由于给各药组所给药物应激宁分别达到了饲料含量的2.5%、5.0%和10.0%（指导原则要求高剂量组应为靶动物摄入量的100倍），从而一定程度上降低了饲料的能量、蛋白质和其他营养物质的含量和影响了适口性，因而造成饲料摄入量应该较多的公鼠在给药早期（第1、2周）采食量相对减少，体重增加亦较少。另外，从整个给药试验的前45d、后45d及90d的周均增重率来比较，所有试验给药的高、中、低剂量公、母鼠各组与空白对照组均无显著差异，说明在大鼠适应含药饲料后，应激宁对大鼠体增重没有大的影响。试验结束时，各试验组公鼠的平均体重均比空白对照组低近30g，因为各组内标准差比较大，只有中剂量组的均重显著低于空白组（P＜0.05），低剂量组和高剂量组与空白组差异不显著。造成体重差异的原因，还是与各试验组公鼠的采食量比空白组低有关，整个试验期间空白组、低剂量组、中剂量组和高剂量组采食量分别为1,271.69g、1,124.76g、1,153.04g、1,199g，低剂量组的采食量最低，比空白组低近147g，同时添加中药后饲料的能量和蛋白质含量相应降低，导致各试验组大鼠试验结束后体重比空白组低很多；因为添加更多的中药中剂量组和高剂量组饲料的能量和蛋白质比低剂量组的更低，但是这两组的采食量比低剂量的高、高剂量组的采食量比中剂量组的高，所以这三组的增重比较接近。

表2 对大鼠采食量、饮水量的影响（n=10）

表3 连续投喂45d对Wistar大鼠血液学及血液生化参数的影响（n=10）

2.3 对大鼠采食量和饮水量的影响

试验期间对各组大鼠的采食量和饮水量进行统计分析，结果显示：除第1周各给药组公鼠的采食量显著低于空白对照组（P＜0.05，这与大鼠对含药饲料的适应性有关），各给药组母鼠的采食量略低于空白对照组外，其余各周各给药组公母鼠的采食量和饮水量与空白对照组相比均无显著差异（P＞0.05），详细结果见表2。说明在大鼠适应含药饲料后，应激宁对大鼠的采食量和饮水量没有明显影响。

表4 连续投喂90d对Wistar大鼠血液学及血液生化参数的影响（n=10）

2.4 对大鼠血常规和血液生化指标的影响

连续给药45d和90d后，对各组一半大鼠的血液学指标和血液生化指标分别进行了检测统计分析，结果显示：各剂量组的血液学指标和血液生化指标测定值与对照组相比均无显著性差异（P＞0.05），详细结果见表3、表4。说明应激宁按高、中、低剂量混饲连续给药90d，对大鼠血常规和血液生化指标未造成影响。

2.5 对大鼠主要脏器系数的影响

连续给药45d和90d后，各组分别取一半大鼠扑杀，剖检观察、称量主要脏器，统计分析各脏器系数。结果显示：所有给药组的各器官脏器系数与空白对照组相比均无显著差异（P＞0.05），详细结果见表5。说明应激宁按高、中、低剂量混饲连续给药90d，对大鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃、睾丸/卵巢子宫的生长发育均没有影响。

2.6 对重要器官组织的病理影响

连续给药45d和90d后，各组分别取一半大鼠采血后扑杀，肉眼观察各组大鼠主要内脏器官，结果显示：给药的各剂量组和空白对照组大鼠的脏器均未发现异常病变。然后分别采集空白对照组和高剂量组大鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃肠、睾丸或子宫组织用10%福尔马林溶液固定，制作石蜡组织切片，经HE染色，显微镜观察，亦未发现异常的组织病理学变化，详见附图。

3 结果分析

连续给药90d应激宁各剂量组大鼠的增重率、摄食、血常规及血液生化指标与对照组相比，均未发生显著性变化（P＞0.05）；剖检和组织学观察肝、肾、心、脾、肺、睾丸或子宫等重要器官组织均未发现异常的组织病理学变化。

4 结论

在试验条件下，未发现应激宁对大鼠的生长发育产生不良影响，90d连续给药无亚慢性毒性。体重的差异与采食量和摄入的能量及营养物质含量下降有关。

表5 对大鼠主要脏器系数的影响（n=10）