牙龈卟啉单胞菌在口腔—消化道肿瘤中的感染情况分析

孔金玉，原 翔，刘怡文，孙 蔚，谷变利，兰子君，高社干

肿瘤的发生发展常伴随一系列遗传和表观遗传的改变，受饮食、环境和微生物暴露以及宿主免疫等的影响。自幽门螺杆菌与胃癌的因果关系确定以来[1]，不同种类的细菌感染及其相应的局部微生态的失衡与肿瘤发生发展的关系成为近年肿瘤研究的热点之一。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis, Pg)是一种革兰氏阴性厌氧菌，是牙周病变主要的优势菌，是毒力最强的致病菌之一[2]。口腔颌面部静脉瓣膜缺如，且血供丰富，致病菌可以轻易地随血液循环至全身。已有研究证实Pg与口腔癌、胰腺癌的发生发展相关[3-4]。本团队前期研究显示Pg与食管癌的发生发展有相互关联性[5-6]。本研究旨在检测Pg在口腔及消化道肿瘤中的感染情况，相关结果现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料收集2012年1月至2018年12月河南科技大学第一附属医院手术切除的口腔及食管鳞癌组织标本各50例，贲门、胃癌各30例及结直肠癌35例。肿瘤标本取自原发灶，取出后一部分置于液氮迅速冷冻，-80 ℃冰箱冻存待用，一部分经甲醛固定，石蜡包埋。所有患者均经病理学确诊为癌，且术前均未接受放化疗及免疫治疗，并于术前获得患者书面知情同意。本项目经过医院伦理委员会的同意。

1.2 主要试剂兔抗人Pg蛋白多克隆抗体获赠于美国路易斯维尔大学实验室，被用于检测Pg感染；免疫组织化学SP超敏试剂盒、DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；柠檬酸抗原修复液(pH6.0)、苏木精、中性树胶购自索莱宝生物科技有限公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒购自诺唯赞公司；Pg上游引物：5’-AGGCAGCTTGCCATACTGCG3’及Pg下游引物5’-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’。

1.3 免疫组化癌组织经10%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制成3 μm厚石蜡切片。切片经0.01 mol·L-1柠檬酸盐缓冲液抗原高压热修复，采用免疫组织化学SP法，兔抗人Pg多克隆抗体浓度为1∶1 000，以0.01 mol·L-1的PBS(pH值7.5)代替一抗作为阴性对照，以组织中显示棕黄色为Pg表达阳性。根据组织切片胞浆及胞核着色的强度和染色面积进行综合评分，在组织切片中，随机挑选4个高倍镜视野观察(200倍)，染色强度：0分，未着色；1分，呈浅黄色；2分，呈棕黄色；3分，呈棕褐色；染色面积：阳性细胞所占比例0%～5%，0分；6%～25%，1分；25%～75%，2分；>75%，3分；免疫组化评分计算方法：染色强度乘以染色面积得总分，1～12分分别代表：0分，-，阴性；1～3分，++，弱阳性；4～8分，++，中阳性；9～12分，+++，强阳性。为方便统计，将“-”定为阴性，“+” “++”和“+++”定为阳性。

1.4 qPCR取冻存的癌组织样本100 mg在液氮中研磨至粉末状，加1 mL Trizol并按说明书提取总RNA，Nano-Drop 2000c(Thermo公司)微量紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度，1%琼脂凝胶电泳鉴定RNA完整性，根据逆转录试剂盒说明书(Vazyme公司R222-01)，总反应体系为20 μL。逆转录反应条件：25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。根据Q-PCR试剂盒说明书(Vazyme公司 Q111-02)，每个PCR反应体系为20 μL，每个样本设3个复孔，用BIO-RAD荧光定量PCR仪进行定量检测。反应条件：95 ℃变性 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s(采集荧光)；40 个循环。

1.5 统计学处理用SPSS 19.0统计学软件进行分析，采用χ2检验分析免疫组化和qPCR两种方法的一致性，以α=0.05为检验水准，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化法检测Pg在口腔—消化道肿瘤组织中的感染情况应用免疫组化法分别检测口腔、食管鳞癌各50例，贲门、胃癌各30例及结直肠癌35例组织中Pg的阳性率。结果发现Pg主要位于细胞质，阳性染色呈棕黄色颗粒，见图1。Pg在口腔、食管鳞癌组织中的阳性率分别为60.00%(30/50)和46.00%(23/50)；在贲门、胃、结直肠癌组织中的阳性率分别为20.00% (6/30)、6.67%(2/30)、2.86%(1/35)，见表1。

A、C、E、G、I分别为Pg染色阳性的口腔鳞癌、食管鳞癌、贲门癌、胃癌、结直肠癌组织；B、D、F、H、J分别为Pg染色阴性的口腔鳞癌、食管鳞癌、贲门癌、胃癌、结直肠癌组织。图1 Pg在口腔—消化道肿瘤中的感染情况(DAB，×400)

2.2 qPCR法检测Pg在口腔—消化道肿瘤组织中的感染情况应用qPCR法分别检测50例口腔鳞癌、50例食管鳞癌、30例贲门癌、30例胃癌及35例结直肠癌组织中Pg的阳性率。结果显示Pg在口腔、食管鳞癌组织中的阳性率分别为56.00%(28/50)和42.00%(21/50)；Pg在贲门、胃、结直肠癌组织中的阳性率分别为16.67% (5/30)、3.33%(1/30)、2.86%(1/35)。Pg在口腔—消化道中的感染情况呈现上高下低的特点。

表1 Pg在口腔—消化道肿瘤中的感染情况 例(%)

2.3 两种方法检测Pg的一致性分析所有样本应用χ2检验分析免疫组化和qPCR检测Pg阳性率的一致性。结果显示免疫组化与PCR法的结果具有一致性，一致率为91.8%，一致性系数Kappa为0.806，P<0.001，见表2。

表2 两种方法检测Pg的一致性分析

3 讨论

Pg是寄居于口腔牙龈上皮细胞内的一种革兰氏阴性厌氧菌，作为口腔中的“红色复合体”三大致病菌之一[7]，Pg已被证实是整个口腔微生态平衡的关键细菌。口腔特殊的解剖结构与环境赋予Pg重要的病理生理学意义，广泛的血源性侵入可促进Pg参与全身系统性疾病进程。新近研究发现，Pg可不间断侵入感染大脑，破坏神经元，是阿尔兹海默症的高危险因素[8]。近年来大量研究结果已表明，Pg抗体水平与冠状动脉粥样硬化、呼吸道感染及骨质疏松等系统性疾病临床风险皆呈正相关[2,9-10]。更为严峻的是，作为介导长期慢性感染而致癌的重要致病菌之一，Pg已被证实为头颈部鳞癌重要病因之一[11-12]。

本研究结果显示，Pg定植于口腔鳞癌组织中，感染率为56.00%，目前国内外已有相关研究。2011年，Katz等[3]在一项分析报告中采用抗Pg (ATCC 33277)特异免疫组化法，比较了10例口腔鳞癌和5例健康受试者口腔组织样本中Pg的表达，发现Pg在口腔鳞癌肿瘤组织中的表达远高于正常组织，作者同时选择共生细菌，链球菌戈登作为参照，而后者未表现出任何表达差异。尽管此次研究的样本量较小，却首次确切报道了Pg感染与口腔鳞癌发生的显著正相关性。自此，许多研究开始探索Pg参与致癌作用的机制[13]，尽管如此，Pg在口腔鳞癌发病中的作用仍不清楚，其潜在的机制待进一步研究。

本研究发现Pg在食管鳞癌、贲门及胃癌中的感染率分别为42.00%、16.67%、3.33%，与本团队之前研究报道一致[5]。本团队2016年在国际上首次发现Pg是食管癌的高危因素[6]，2017年研究证实Pg在食管癌和癌前病变组织中广泛定植，癌旁及正常黏膜组织中则丰度较低，在贲门和胃癌中的含量很低或没有，这种差异被归因于Pg对pH酸性环境的低耐受性[5]。Salazar等[14]2013年在一项包含37例慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生或不典型增生的牙周炎患者的临床研究中，采用实时荧光定量PCR法在上述患者的牙菌斑和唾液样本中检测了包括Pg在内的几种牙周致病菌的DNA表达水平。结果显示，3种牙周致病菌，Pg、Td(Treponemadenticola)、Tf(Tannerellaforsythia)在牙菌斑中的定植，可增加胃癌癌前病变的发生风险。以上报道均提示Pg可能以某种方式参与了肿瘤的发生发展。

本研究同时发现，在结直肠癌组织中也存在Pg感染，感染率较低(2.86%)，目前国内外尚无相关报道。2013年，Wu等[15]发表的病例对照研究报告中，采用16S rRNA基因焦磷酸测序检测了19例结肠癌患者及20例健康受试者粪便微生物的变化，发现卟啉单胞菌属在结肠癌患者的粪便样本中远高于健康受试者。Hale等[16]的研究表明在结肠腺瘤患者粪便样本中口腔菌属的数量，包括放线菌属、棒状杆菌属、嗜血杆菌属、念珠菌属和卟啉单胞菌属明显高于对照组。2017年，也有研究显示在结直肠癌患者的粪便样本中发现了更多的牙周病原体，如梭杆菌、颤螺旋菌属、消化链球菌、卟啉单胞菌、罗斯氏菌和瘤胃球菌[17-18]。上述研究仅仅在结直肠癌患者的粪便中发现了卟啉单胞菌，并未在其癌组织中发现Pg，本研究首次发现结直肠癌组织中Pg的感染。

综上所述，Pg在口腔癌中感染率最高，但在结直肠癌中感染率低至2.86%，提示Pg在口腔—消化道肿瘤中感染呈上高下低的分布规律，Pg可能通过口腔进入食管及贲门组织，又由于胃酸的原因，在胃及结肠中几乎消失。这些数据表明，根除口腔致病菌可能有助于口腔及食管、贲门癌的防治。