鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301发酵乳改善大鼠非酒精性脂肪肝特性研究

梁娇娇，顾瑞霞，陈大卫，瞿恒贤，张臣臣，关成冉，马文龙，张龙飞，陈春萌，肖丽霞

（扬州大学江苏乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏扬州225127）

0 引 言

非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）作为世界范围内成人和儿童最常见的一种慢性肝病[1-2]，具有发病机制复杂、诊断困难以及引发心血管疾病等问题，使治疗NAFLD 面临巨大的挑战。目前，饮食与运动干预是治疗NAFLD 的最基本方法[3]。近年来，越来越多的研究表明，肠道微生物可能是联系饮食与人体健康之间的桥梁，通过调节饮食的摄入状况可以调控肠道微生物的组成和结构，进而影响肠道中营养物质的代谢和人体生理状态。因此，通过益生菌干预肠道微生物的方法为治疗NAFLD 提供了新的方向和思路。

已有研究表明，益生菌作为肠道微生态调节剂能有效地改善肠道菌群结构，调控小肠细菌过度生长，改善肝代谢功能[4-7]。如 Iacono 等[8]通过对 NAFLD 患者的肠道菌群培养发现，非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者存在不同程度的肠道菌群失调。Ritze等[9]报道了鼠李糖乳杆菌对NAFLD 的保护作用，在高糖饮食诱导的NAFLD 模型小鼠中，鼠李糖乳杆菌干预能增加有益细菌数量，恢复肠屏障功能，减弱肝脏炎症和脂肪变性。

牛乳作为益生菌的最佳天然载体，在发酵期间，不仅能利用脱脂乳中的营养物质进行生殖代谢，还根据不同的培养条件，使得发酵乳的代谢产物发生变化，为肠道菌群进行氨基酸、碳水化合物和胆汁酸等代谢活动提供了物质基础[10-12]。Mahak 等[13]研究发现，植物乳杆菌M-13 在燕麦粉中发酵72 h 后，活菌数达到14.4 log cfu/mL，乳酸含量增加，具有较强的代谢活性。Miao 等[14]报道了益生菌副干酪乳杆菌亚种经72 h 长时间发酵可生产出最佳的抗菌药物。但是，目前关于较长时间发酵乳在体内的益生特性研究较少。

本实验室前期研究发现，鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 72 h 发酵乳较17 h 含有丰富的风味物质、氨基酸等有益物质，且体外益生特性较也好于17 h 发酵。因此，为进一步验证鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 干预对非酒精性脂肪肝大鼠的体内益生作用，本文通过17 h 和72 h 制备的发酵乳对非酒精性脂肪肝大鼠进行干预，探讨其通过调节大鼠血清中的生化指标、游离脂肪酸、活性氧及炎症因子来改善大鼠非酒精性脂肪肝的特性，为益生菌功能开发和产品应用性能强化提供指导意义。

1 实 验

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌株

鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301（Lactobacillus rhamnosushsryfm 1301），扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室保藏。

1.1.2 动物及饲料

6 周龄 SPF 级 Wistar 雄性大鼠，40 只，由扬州大学比较医学中心提供，大鼠饲养及实验均在本院清洁级实验动物室内进行。

普通饲料（面粉20%、米粉10%、玉米20%、鼓皮26%、豆料20%、鱼粉2%、骨粉2%）、高脂饲料（10%猪油、10%蛋黄粉、1%胆固醇和0.2%胆盐和78.8%基础饲料），由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供。

1.1.3 主要试剂

总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）,南京建成生物工程研究所；活性氧（reactive oxygen species，ROS）、游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、核转录因子-κB（NF-κB）、白细胞介素-1β（IL-1β）试剂盒,上海华蓝化学科技有限公司。

1.1.4 仪器与设备

5804R 型高速冷冻离心机,德国Eppendorf 公司；RM225 组织切片机，德国莱卡公司；Axiocam erc5s 型生物显微镜，德国Carl. Zeiss 公司；7020 型全自动生化分析仪，日本株式会社日立制作所；1510 酶标仪，美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌培养

将保藏的鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 按3%接种量接种到改良MRS 液体培养基中，置于37 ℃厌氧培养，活化3代。

1.2.2 灌胃样品的制备

将活化三代的鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 按3%接种量接种在发酵复原脱脂乳中发酵，分别发酵17 h 和72 h，采用平板计数法进行活菌计数，调整活菌数为109CFU/mL，4 ℃保藏备用。

1.2.3 动物分组及处理

图1 大鼠分组及处理情况

1.2.4 样品的采集与处理

于末次灌胃后，大鼠禁食不禁水12 h，毛细血管取血，37 ℃ 培养箱孵育30 min，3 500×g 离心20 min分离血清，-80 ℃保存备用。迅速取出肝脏，称重，取0.5 cm3，放于4%多聚甲醛固定，存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.5 大鼠体重及饮食量

实验期间每天称量、记录饲料剩余量，每周定期称量、记录各组大鼠体重。大鼠处死前测定空腹体重。计算食物效应比（摄入每克食物造成的体重增加）。

1.2.6 观察大鼠组织病理学变化

将固定于4%多聚甲醛溶液中的肝组织取出，进行石蜡包埋、切片、HE 染色等一系列操作，在光镜下观察肝组织的病变情况以及肝细胞形态结构。

1.2.7 指标检测

由图4可知，当荷叶发酵上清稀释至200～4 000倍后，其对 Caco-2细胞的存活率无显著性差异(P>0.05)。后续实验选用200倍，即荷叶发酵上清浓度200 μg·mL-1测定细胞抗氧化活性。

1.2.7.1 测定血清中生化指标含量

TC、TG、HDL-C、LDL-C、AST、ALT、SOD 均由7020型日立全自动生化分析仪测定。

1.2.7.2 测定血清中游离脂肪酸（FFA）、活性氧（ROS）含量

FFA、ROS 采用酶联免疫测定法，按照 ELISA 试剂盒操作说明书进行测定。

1.2.7.3 测定血清中细胞因子含量

TNF-α、IL-6、IL-8、TGF-β1、NF-κB、IL-1β采用酶联免疫测定法，按照ELISA 试剂盒操作说明书进行测定。

1.2.8 统计分析

所有数据均采用SPSS 软件处理，采用均值±标准差表示，以单因素方差分析进行显著性检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 鼠李糖乳杆菌hsryfm1301 发酵乳对大鼠体重及食物效应比的影响

高脂饲料喂食8 周，鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳干预4 周，对大鼠的体重和食物效应比产生了重要的影响，如图2所示。

图2 鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳对大鼠体重及食物效应比的影响（n=10，x±sd）

如图2（a）所示，在实验初期各组大鼠初始体重无显著差异（P＞0.05），体重约为216.00 g。随着时间的延长，各组大鼠体重也随之增加。经过8 周喂食及益生菌干预后，Control 组、Model 组、L.1301-17 组和L.1301-72 组大鼠最终体重较初始体重分别增加了132.00 g、188.50 g、164.67 g、151.33 g。与 Model 组相比，L.1301-17 组和L.1301-72 组大鼠体重增加量显著减少（P＜0.05），但L.1301-17 组和L.1301-72 组之间大鼠体重差异无统计学意义（P＞0.05）。进一步比较各组大鼠食物效应比发现如图2（b），L.1301-17 组和L.1301-72 组的食物效应比均显著低于Model 组（P＜0.05），但 L.1301-17 组和 L.1301-72 组之间食物效应比同样无显著差异（P＞0.05）。

2.2 鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳对大鼠血清生化指标的影响

高脂饮食的摄入容易引起机体内生化指标水平的升高，从而引发心血管疾病。鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳干预后对大鼠血清中生化指标水平产生了一定的影响，如图3、4所示。

图3 鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳对大鼠血清血脂的影响（n=10，x±sd）

由图 3 所示，Model 组的 TC、TG 和 LDL-C 含量分别为 2.27 mmol/L、1.79 mmol/L、1.14 mmol/L，与Control 组相比显著增加（P＜0.05）；HDL-L 含量为0.54 mmol/L，显著低于Control 组（P＜0.05）。经鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳干预后，L.1301-17 组TC、TG 以及 LDL-L 含量分别为 2.11 mmol/L、1.47 mmol/L、1.07 mmol/L，与Model 组相比显著降低（P＜0.05）；L.1301-72 组 TC、TG 以及 LDL-L 含量分别为2.06 mmol/L、1.47 mmol/L、1.03 mmol/L，相 较 于Model组显著降低（P＜0.05）；L.1301-17组和L.1301-72组HDL-L 含量分别为0.60 mmol/L、0.60 mmol/L，与Model 组相比显著增加（P＜0.05），但L.1301-17 组和L.1301-72 组两者之间，TC、TG、HDL-L 和LDL-L 无显著性差异（P＞0.05）。

由图 4 所示，Model 组的 ALT、AST 含量分别为61.20 U/L、98.20 U/L，与 Control 组相比显著升高（P＜0.05）；SOD 含量为24.9 U/mL，显著低于Control组（P＜0.05）。经鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳干预 后 ，L.1301-17 组 ALT、AST 含 量 为 54.20 U/L、87.20 U/L，相较于 Model 组均显著降低（P＜0.05），L.1301-72 组 ALT、AST 含量显著降低 Model 组（P＜0.05），分别为 50.60 U/L、86.40 U/L；但 L.1301-17 组和L.1301-72 组两者之间，ALT、AST 无显著性差异（P＞0.05）。同时，L.1301-72 组SOD 含量较Model 组相比显著增加（P＜0.05），为51.28 U/mL；L.1301-17组 SOD 含量为 54.67 U/mL，与 L.1301-72 组相比显著增加（P＜0.05）。

2.3 鼠李糖乳杆菌hsryfm1301 发酵乳对大鼠肝脏病变的影响

高脂饮食的摄入会对机体的肝脏造成严重的损伤，鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳干预后对机体的肝脏起到了一定的保护作用，如图5所示。

如图5 所示，Control 组大鼠肝脏组织无脂肪变性，肝细胞结构完整，界限清晰，具有明显的细胞核；Model 组大鼠肝脏发生脂肪变性，肝细胞结构破坏严重，界限模糊，脂肪堆积明显，含有大量脂肪空泡；L.1301-17 组和L.1301-72 组大鼠肝脏发生脂肪变性现象，但与Model 组大鼠相比肝细胞脂肪堆积减少，脂肪空泡数量减少；L.1301-72 组与L.1301-17 组相比干预效果更佳，大鼠肝脏出现轻微脂肪变性现象，具有明显的细胞核，少量的脂肪空泡。

图4 鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳对大鼠血清ALT、AST、SOD的影响（n=10，x±sd）

图5 鼠李糖乳杆菌 hsryfm 1301 发酵乳对大鼠肝脏病变的影响（×100）

2.4 鼠李糖乳杆菌hsryfm1301 发酵乳对大鼠血清FFA、ROS的影响

FFA 和ROS 是导致肝损伤的重要物质，高脂饲料的摄入引起机体内FFA 和ROS 水平升高，鼠李糖乳杆菌 hsryfm 1301 发酵乳干预后对大鼠体内FFA 和ROS具有一定的调节作用，如图6所示。

图6 鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301发酵乳对大鼠血清FFA、ROS的影响（n=10，x±sd）

由图 6 所示，与 Control 组相比，Model 组 FFA、ROS 含量显著增加（P＜0.05），分别为1597.95 U/L、438.00 U/mL。经鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳干预后，L.1301-17 组 FFA、ROS 含量与 Model 组相比显著降低（P＜0.05），分别为1442.14 U/L、405.40 U/mL；L.1301-72 组的 FFA、ROS 含量为 1188.68 U/L、339.88 U/mL，与Model 组相比显著降低（P＜0.05）；L.1301-72 组 FFA、ROS 的含量与 L.1301-17 组相比显著降低（P＜0.05），其中 L.1301-72 组和 Control 组之间FFA 含量无显著性差异（P＞0.05）。

2.5 鼠李糖乳杆菌hsryfm1301 发酵乳对大鼠血清促炎因子的影响

TNF-α 、IL-6、IL-8 作为反映炎症严重程度的重要指标，在肝细胞损伤发展过程中发挥了重要的作用。TGF-β1 是促进肝纤维化和细胞外基质降解的重要因子，可诱导肝细胞凋亡与坏死[15]。NF-κB 参与对肝细胞凋亡反应的调节，并诱导肝细胞急性期反应基因表达，引起肝脏炎症[16]。高脂饮食的摄入使机体内促炎因子水平升高，鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳干预后对机体内促炎因子起到了一定的抑制作用，如表1所示。

由表1所示，Model组TNF-α、IL-6、IL-8、TGF-β1、IL-1β和 NF-κB 的含量与 Control 组相比显著增加（P＜0.05），分 别 为 196.58 pg/mL、135.79 pg/mL、259.12 pg/mL、93.36 ng/mL、40.69 pg/mL、821.78 pg/mL。经鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳干预后，L.1301-17 组TNF-α、IL-6、IL-8、TGF-β1、IL-1β和NF-κB 的含量分别为 175.80 pg/mL、128.25 pg/mL、240.23 pg/mL、81.51 ng/mL、35.28 pg/mL、665.26 pg/mL，与 Model 组 相 比 均 显 著 降 低（P＜0.05）；L.1301-72 组TNF-α、IL-6、IL-8、TGF-β1、IL-1β和NF-κB 的含量分别为 143.11 pg/mL、112.37 pg/mL、164.17 pg/mL、77.52 ng/mL、26.92 pg/mL、425.55 pg/mL，与 Model 组 相 比 均 显 著 降 低（P＜0.05）；L.1301-72 组TNF-α、IL-6、IL-8、TGF-β1、IL-1β和NF-κB 的含量相比于 L.1301-17 组显著降低（P＜0.05），其 中 L.1301-72 组 和 Control 组 之 间 IL-6、TGF-β1、IL-1β和 NF-κB 的含量无显著差异（P＞0.05）。

3 讨 论

表1 鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301发酵乳对大鼠血清促炎因子的影响（n=10，x±sd）

本研究探讨了鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳对大鼠非酒精性脂肪肝的改善作用。选取17 h和72 h两种发酵时间制备鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳干预非酒精性脂肪肝病大鼠模型。研究表明，鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301发酵乳均可显著降低FFA、ROS和促炎因子的水平，减少氧化应激的产生，改善了由高脂饮食诱导的肝损伤和非酒精性脂肪肝病。因此，鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳对大鼠非酒精性脂肪肝具有改善作用，其中72 h 发酵乳更好地抑制血清中促炎因子、FFA 和ROS 的分泌，可能是长时间发酵产生了大量的代谢物质，从而有利于与宿主产生共代谢关系，进一步促进代谢、抗氧化和免疫等功能。

有研究表明，肥胖、血脂异常、炎症、和氧化应激是引起NAFLD 的主要危险因素[17-20]。本文研究发现，喂食4 周高脂饲料建模及益生菌干预4 周后，L.1301-17 组和 L.1301-72 组的大鼠体重较 Model 组显著减少，表明鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳在不影响饮食摄入的情况下能够减缓大鼠体重的增加。鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳均能显著降低血清中 TC、TG 和 LDL-L 的含量以及升高 HDL-L 的含量，与 Chen 等[21]研究结果一致；AST 和 ALT 是评估机体肝脏功能和肝损伤最主要的两个酶，研究发现鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳干预后显著降低了ALT、AST 的含量，表明鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳可调节血清中转氨酶的水平。Al-Sheraji 等[22]发 现 假 丝 酵 母 G4 和长双歧杆菌536 混合发酵的发酵乳干预 8 周后，HDL 水平升高，主要是由于乳酸菌产生大量的胆盐水解酶（BSH），降低了血清胆固醇的水平。因此，在本研究中L.1301-17 组和L.1301-72 组中血脂指标水平降低的部分原因可能是鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 的BSH 活性。综上，鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳可缓解由高脂饮食带来的血脂代谢紊乱，减轻肝损伤，对非酒精性脂肪肝病具有一定的保护作用。

肝脏病理情况显示，与Model 组相比，经益生菌发酵乳干预后的脂肪空泡数量显著减少，表明鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳能够减轻肝脏脂肪变性程度，对大鼠非酒精性脂肪肝具有改善效果。TNF-α、IL-6等炎症因子，其含量可以反映炎症严重程度，在肝细胞损伤发展过程中发挥了重要的作用。实验结果显示，鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳均显著抑制了促炎因子的分泌，其中72 h 发酵乳抗炎效果优于17 h发酵乳，可能是长时间发酵产生更多的抗炎物质，表明鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 长时发酵乳更好地调节炎症因子的水平，对非酒精性脂肪肝病具有一定的改善作用。综上以上结果，鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳可以改善由高脂饮食诱导的肝损伤。Wang 等[23]研究发现，鼠李糖乳杆菌GG 显著降低了TNF-a 的表达和缓解了肝炎，为本实验结论提供支持。

ROS 的不断积累使机体内抗氧化剂逐渐耗竭，导致氧化应激，从而引起脂肪变性，并与心血管疾病的发生存在一定的关系。Wang 等[24]研究表明，脂多糖可诱导肝癌细胞产生TNF-a，导致ROS 产生。FFA过氧化反应影响线粒体的正常功能，从而导致ROS水平升高。SOD 作为机体内主要的抗氧化酶，可清除ROS 含量，缓解肝损伤。在本研究中，通过鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳干预可降低由高脂饮食诱导的 TNF-α 和 FFA 水平，同时增加 SOD 的含量，与减少血清中ROS 的结果相一致，其中长时发酵乳具有更好的抗氧化作用。 因此，鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳可调节FFA 和ROS 的水平，具有抗氧化作用，改善了肝细胞的损伤程度，对非酒精性脂肪肝病具有一定的改善作用。

4 结 论

鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 发酵乳的摄入缓解了脂肪在肝脏上的堆积，控制了血脂水平，清除了游离脂肪酸和活性氧物质的释放，抑制了炎症因子的激活，减轻了肝损伤，对大鼠非酒精性脂肪肝具有改善作用，为益生菌功能开发和产品应用性能强化提供指导意义。其中，鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 长时发酵乳具有更好地抗氧化、抗炎的益生特性，其具体作用机制需从分子水平深入探讨。