三种皮肤修复材料对糖尿病大鼠皮肤损伤修复的有效性评价

韩倩倩 曲明悦 薛彬 王春仁

皮肤修复材料作为近年来新的皮肤损伤修复方式，显示出良好的前景。糖尿病足等难愈性创面的皮肤修复对材料的性能和有效性有更高的要求，本研究采用STZ腹腔注射建立糖尿病大鼠模型，并在其背部形成全层皮肤缺损创面，以构建糖尿病大鼠皮肤损伤模型，用于评价胶原蛋白膜、羧甲基壳聚糖止血海绵和明胶生物活性玻璃复合材料对难愈性皮肤损伤的修复作用，为相关研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料及溶液配制

柠檬酸钠缓冲溶液配制：2.10 g柠檬酸加100 mL双蒸水配成柠檬酸母液； 2.94 g柠檬酸三钠加100 mL双蒸水配成柠檬酸钠母液；将柠檬酸母液和柠檬酸钠母液按1∶1.32的比例混合，调节pH至4.0～4.5，得到所需的0.1 mol/L的柠檬酸钠缓冲溶液。

STZ溶液配制：将STZ溶解于柠檬酸钠缓冲液中，配成浓度为10 mg/mL的STZ溶液，用滤菌器过滤除菌后避光保存，现用现配。

胶原蛋白膜、羧甲基壳聚糖止血海绵(杭州英健生物科技有限公司)，明胶生物活性玻璃复合敷料(上海硅健生物材料有限公司)。

1.2 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，7～8周龄，体质量约200 g(中国食品药品检定研究院实验动物资源中心)。

1.3 实验方法

1.3.1 糖尿病大鼠皮肤损伤模型的建立

SD大鼠适应性饲养7 d后随机分成5组，每组8只。禁食一晚，空腹血糖<6.1 mmol/L的大鼠用于建立糖尿病大鼠模型。按照25 mg/Kg、50 mg/Kg、75 mg/Kg和100 mg/Kg的剂量腹腔注射STZ溶液，空白对照组注射柠檬酸钠缓冲溶液。每天密切观察所有试验大鼠的一般情况。注射后第7、14、21和28天尾尖采血检测非空腹血糖值。

将15只SD糖尿病大鼠随机分成3组，麻醉，备皮，于双耳连线中间向下大约8 cm处，以脊柱为中线分别切除1 cm×1 cm、2 cm×2 cm、3 cm×3 cm的正方形全层皮肤，深至肌层，用无菌纱布覆盖创面，医用胶带固定。术后动物单笼饲养，第0、5、12、21天观察创面愈合情况。

1.3.2 三种材料对创面的有效性评价

将三种材料(胶原、羧甲基壳聚糖、明胶生物活性玻璃)剪至2 cm×2 cm大小。将80只SD糖尿病大鼠皮肤损伤模型随机分为4组：空白对照组(n=20)、胶原组(n=20)、羧甲基壳聚糖组(n=20)、生物玻璃组(n=20)。胶原组、羧甲基壳聚糖组、生物玻璃组将相应样品直接敷在皮肤缺损创面，并用无菌敷料贴覆盖；空白对照组直接用无菌敷料贴覆盖创面。术后所有大鼠均单笼饲养，每2天观察实验鼠的精神、活动和饮食变化，第3、7、14、21天打开敷料观察创伤愈合与炎症情况，拍照，作好观察记录，并在第14、21天取材进行病理切片检查。

1.4 检测指标

1.4.1 大体创面恢复情况

记录造模后第3、7、14、21天大鼠创面渗出、黏连以及创口回缩等情况，大体判断创面的恢复情况。

在34篇研究文献中，我们可以发现大多数的研究主要针对大学本科及以上的学生，而对于中小学的研究却很少。即使是大部分实验研究，实验对象也更多是对于大学本科生，如毕鹏晖（2017）针对大二学生的问卷和访谈得出结果研究大学英语微移动词汇学习融入形成性评估模式；李思萦、高原（2016）以4组非英语专业研究生为对象,通过测试考察了移动技术辅助外语教学与多模态结合对学习者词汇习得的影响；孔繁霞、王歆（2014）基于“投入量假设”理论,探讨了93名非英语专业二年级学生在阅读、听力、写作任务中的词汇附带习得效果等。

1.4.2 创面愈合率

造模后第3、7、14、21天对创面进行拍照(距离和曝光方式相同)，用图像分析系统(Image Pro)测算创面愈合率。

1.4.3 组织学检查

造模后第14、21天，在创面上切取约1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的皮肤组织，宜包含周围正常皮肤组织， HE染色后观察各时间点各组大鼠皮肤创面的修复情况和肉芽组织生长、炎症反应等。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 糖尿病大鼠模型建立

注射STZ后，25 mg/Kg STZ组非空腹血糖值未到达糖尿病血糖标准(高于16.7 mmol/L)，动物精神状态良好，毛发光泽；50 mg/Kg STZ组部分大鼠非空腹血糖值>16.7 mmol/L，成模率为50%；75 mg/Kg STZ组所有大鼠血糖值均>16.7 mmol/L，动物精神状态差，弓背捲体，动作缓慢，毛发无光泽，成模率100%；100 mg/Kg STZ组动物注射STZ后2 d内死亡5只，4 d内全部死亡。因此，确定以75 mg/Kg STZ单次腹腔注射构建糖尿病大鼠模型(图1)。

图1 各剂量组动物血糖变化情况Fig. 1 Changes of blood glucose in different concentration groups

2.2 皮肤损伤模型建立

图2 术后第0、5、12、21天各组创面愈合情况Fig. 2 Skin wound healing at day 0, 5, 12, 21 after resection

2.3 三种修复材料的有效性评价

2.3.1 创面恢复情况

各组大鼠均未出现感染及死亡情况。术后第3天，空白对照组动物创面明显红肿、渗出，创面边缘无收缩迹象；3种材料组的创面处均较干净，无渗出，伤口边缘皮肤开始向内收缩。术后第7天，对照组仍有明显渗出，伤口边缘开始收缩；3种材料组伤口收缩明显，创面均被肉芽组织填满；术后第14天，对照组创面缩小，结痂；胶原组和生物玻璃组痂皮脱落，创面被新生的表皮覆盖。术后第21天，空白对照组痂皮脱落，被新生表皮覆盖；3个样品组创面已基本愈合。

2.3.2 创面愈合率

造模后第3、7、14、21天对创面进行拍照(每只动物拍照距离和曝光方式相同)，用图像分析系统(Image Pro)测算创面愈合率。结果显示，术后第3、7、14和21天，胶原组和生物玻璃组的创面愈合率均高于空白对照组，且具有显著性差异(P<0.01)；而羧甲基壳聚糖组的创面愈合率只在第3天略高于对照组，其余三个时间点均低于空白对照组，但无统计学差异(P>0.05)(图3)。

图3 各组创面愈合率比较(**： P<0.01)Fig. 3 Wound healing rate of each group (**： P<0.01)

2.3.3 组织学检查

术后第14天，胶原组和明胶生物玻璃组表皮已基本覆盖全部创面，且出现层次分明的表皮、真皮结构，有小血管增生，皮肤附属器清晰可见；羧甲基壳聚糖组仍有部分创面未被表皮覆盖，未形成层次分明的表皮、真皮结构，真皮层内可见毛细血管的闭合、退化和消失，未见皮肤附属器；空白对照组部分创面无表皮覆盖，仍可见较多的新生血管和成纤维细胞，无皮肤附属器；术后第21天，胶原组和明胶生物玻璃组可见完整的皮肤结构，可见皮肤附属器；羧甲基壳聚糖组虽然仍未见皮肤附属器长出，但出现层次分明的表皮、真皮结构；空白对照组大部分创面已被表皮覆盖，出现完整的皮肤结构，虽然无皮肤附属器长出，但创面已基本愈合(图4)。

A：空白对照组；B：胶原组；C：羧甲基壳聚糖组；D：明胶生物玻璃组a: Control group; B: Collagen group; C: Carboxymethyl chitosan group; D: Gelatin bioactive glass group图4 各组创面术后第14、21天组织学观察Fig. 4 Histological observation on skin wound healing 14, 21 days after treatment

3 讨论

正常的创面愈合涉及一系列级联事件，包括止血/炎症期、增殖期和重塑期[1]。各种炎症因子、细胞因子、激素等参与修复反应[2-6]。在严重的病理条件下，如烧伤、烫伤、糖尿病创面，所有这些形态学事件都受损，阻碍正常的再上皮化和真皮修复过程，是皮肤组织创伤治疗中最主要的挑战。近年来，皮肤修复材料替代物在治疗皮肤损伤方面提供了新的机会。多种皮肤敷料，包括丝素蛋白[7-8]、海藻酸钠[9-10]、壳聚糖[10-12]、胶原蛋白[13-14]和明胶[14-15]等，正被用于促进愈合过程和保护皮肤免受进一步损害。构建合适的皮肤损伤模型，为皮肤修复材料有效性的验证奠定基础，是当前面临的重要任务。

糖尿病是胰岛素分泌不足或胰岛素作用障碍导致的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，其发病率呈逐年上升的趋势。糖尿病患者有10%～25%的几率并发糖尿病足[16]，系由感觉神经病变、足部畸形和动脉循环不足共同引起[17]，全球的发病率在4%～10%之间[18-19]。因此，构建糖尿病大鼠的皮肤损伤模型，可有效模拟疾病的发生发展状况，为探索相关的发病机制及皮肤修复材料有效性提供基础。

链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)是一种能破坏胰岛β细胞的抗生素，已被证明具有致糖尿病的特性[20]，现被广泛应用于Ⅰ型糖尿病的实验研究[21-24]。此外，大鼠因大小适宜、诱导期短、易于诱导病情和成本效益[25]，具有明显的优势，SD大鼠和Wistar大鼠对STZ尤为敏感，并且雄激素能增强大鼠对STZ诱导的糖尿病的敏感性[26]，因此本研究选用雄性SD大鼠，通过腹腔单次注射STZ溶液以构建糖尿病模型。实验结果显示，100 mg/Kg STZ浓度过高，大量胰岛β细胞坏死和胰岛素突然释放导致了致死性低血糖症，引起大鼠死亡。75 mg/Kg的STZ注射后大鼠血糖符合标准(高于16.7 mol/L)，且有更高的成模率(100%)，因此确定75 mg/kg的STZ单次腹腔注射构建糖尿病大鼠模型。

在糖尿病大鼠背部分别进行不同大小的全层皮肤切除，以寻找皮肤损伤模型的最佳创面大小。结果显示，2 cm×2 cm组术后修复较1 cm×1 cm组平缓，利于皮肤修复材料有效性的比较。至此，标准化糖尿病大鼠皮肤损伤模型正式建立，即单次腹腔注射75 mg/kg STZ溶液，并在背部构建2 cm×2 cm的全层皮肤缺损。

理想的创面敷料应该使用方便，能够促进创面愈合，无毒、非过敏、隔热、不渗透细菌，允许适当的气体交换并具有成本效益[27]。本研究中所使用的胶原蛋白[13]、羧甲基壳聚糖[28]、生物玻璃[29]促进皮肤伤口愈合的作用均有报道。本研究以糖尿病大鼠皮肤损伤模型来评价三种材料对于修复难愈性创面的有效性。大体观察显示，3种材料组的愈合情况均优于对照组；创面愈合率比较显示，胶原组和生物玻璃组术后第3、7、14、21天的愈合率均高于空白对照组，促进皮肤愈合效果明显，而羧甲基壳聚糖组因其明显的止血效果，在恢复早期(第3天)效果较好，后期的创面愈合率均低于空白对照组，但无明显差异，没有促进皮肤愈合的效果。HE染色结果显示，术后第14天，胶原组和生物玻璃组已出现层次分明的表皮、真皮结构，皮肤附属器清晰可见，皮肤愈合程度明显优于对照组，羧甲基壳聚糖组仍未形成层次分明的表皮、真皮结构，未见皮肤附属器，愈合效果不佳；术后第21天，各组动物皮肤均已基本愈合。

综上所述，本研究利用STZ和背部皮肤全层损伤成功建立糖尿病大鼠皮肤损伤模型，胶原蛋白和明胶生物活性玻璃均可对难愈性皮肤损伤进行有效修复，羧甲基壳聚糖仅表现为止血作用，未能有效促进伤口愈合。