葡萄籽提取物原花青素对UVA照射HaCaT细胞表达VEGF及PEDF mRNA影响的研究

史云容，张峻岭，康元

（1.山东省济宁市第一人民医院，山东济宁272000；2.天津市中医药研究院附属医院，天津300120；3.天津中医药大学附属第一医院，天津300193）

皮肤老化，除了自然老化最重要的是紫外线照射引起的光老化。光老化皮肤表现为暴露部位皱纹加深、皮肤松弛，色素沉着与色素减退，毛细血管扩张及皮肤微循环的改变等[1]。长期反复的紫外线照射是引起皮肤光老化的主要元凶，为了探讨葡萄籽提取物原花青素（Grape-seed proanthocyanins，GSPE）是否可以改善光老化皮肤的微循环改变及血管扩张，设计进行了本实验。

1 材料与方法

1.1 实验材料 DMEM高糖液态培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、D-Hank’s液均购自天津灏洋生物科技有限公司，噻唑兰（MTT）比色法细胞增殖及细胞毒性检验试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司，葡萄籽提取物原花青素（GSPE）为天津市尖峰天然产物研究开发有限公司赠送，TRANScript cDNA第一链合成试剂盒、SYBR GreenⅠ、TRIzol购自天根生化科技有限公司，引物由徐世文教授设计惠赠，GAPDH引物序列根据PubMed基因库提供的等位基因核苷酸序列设计，均由南京金瑞斯生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将HaCaT细胞以密度为1×105/mL接种于25 cm2培养瓶，8 mL（血清含量10%）培养基中。培养条件37℃，5%CO2进行培养，隔天换液1次，待细胞密度到达1×106～2×106/mL时进行传代。取细胞对数生长期、密度近1×106/mL（融合度近80%）时进行实验。

1.2.2 长波紫外线（UVA）照射 照射光源为SS-03A UVA光疗仪，波长320～400 nm，照射距离为15 cm。待HaCaT细胞生长至约80%融合，弃培养基，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，96孔板加入约150 μL PBS或D-Hank’s液形成细胞上液面。分别用剂量为0、8、10、15、20、25、30、40 J/cm2UVA 照射 HaCaT 细胞，24 h后检测其增殖活性。

1.2.3 实验分组 空白对照组、单纯光照组（25 J/cm2的UVA照射）及照光加药组（GSPE的实验浓度经预实验筛选后分别设定为 10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL），共 5 组，实验重复 3 次。

1.2.4 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法 引物序列根据PubMed基因库提供的等位基因核苷酸序列设计，由南京金瑞斯生物科技有限公司合成。首先提取总RNA后进行浓度和纯度的鉴定及完整性的检测。再以GAPDH为内参基因进行一系列RTPCR反应。目的基因与内参的扩增斜率差值＜0.1，可以应用ΔΔCt进行定量分析。

1.3 统计学方法 所有数据用SPSS 17.0进行统计，符合正态分布以s表示，多个样本均数比较用单因素方差分析，其中两两间比较用最小显著差（LSD）法比较，显著性检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 单纯光照组比空白对照组VEGF mRNA的表达量升高（P＜0.05）。相比单纯光照组，照光加药物各组 VEGF mRNA的表达量低（P＜0.05），且呈浓度依赖性。当药物浓度为100 μg/mL时可使VEGF mRNA表达量接近正常水平（与空白对照组比 P＞0.05）。

2.2 单纯光照组比空白对照组色素上皮衍生因子（PEDF）mRNA的表达量降低（P＜0.05），照光加药各组比单纯光照组PEDF mRNA的表达量高（P＜0.05），且当 药 物 浓度为 50 μg/mL、100 μg/mL 时可 使PEDF mRNA的表达量接近正常水平（与空白对照组比 P＞0.05）。

表1 各组VEGF和PEDF mRNA相对表达量分析 （2-ΔΔCt，±s）

表1 各组VEGF和PEDF mRNA相对表达量分析 （2-ΔΔCt，±s）

注：两两间比较采用LSD法分析，两基因的其他各组与单纯光照组比，所有组*P＜0.05为差异有统计学意义。余各组与空白对照组比，#P＜0.05为差异有统计学意义。

组别 VEGF PEDF空白对照组 1.00* 1.00*单纯光照组 1.51±0.06# 0.65±0.18#照光加 GSPE 组 1（10 μg/mL） 1.27±0.10*△ 0.86±0.06*#照光加 GSPE 组 2（50 μg/mL） 1.17±0.07*# 0.89±0.03*照光加 GSPE 组 3（100 μg/mL） 0.92±0.08* 0.93±0.10*F 53.19 9.24

3 讨论

随着光老化研究的深入，越来越多的证据表明血管因素与紫外线引起的色素沉着有关。近期Hasegawa等[2]报道了24例面部日光性黑子患者活检的研究，免疫组化结果一致显示，血管密度显著增加，血管内皮生长因子表达水平升高。所以血管因素也是研究皮肤光老化的一个重要窗口。

VEGF和PEDF已被证明是在生理病理条件下影响血管生成平衡的重要因子[3]。VEGF又称血管渗漏因子，是机体内影响血管结构和功能的重要细胞因子，有多种生物功能，例如能促进血管内皮细胞增殖和迁移，诱导毛细血管管腔的形成，延长血管内皮细胞寿命，增强血管通透性等作用。已有研究显示紫外线照射可上调VEGF的表达[4]，但新生的血管表现出通透性增高和渗透性增加，再加上从新生血管中渗漏出的炎性细胞与其产生的炎性介质，共同造成的急性炎性反应导致了细胞外基质蛋白的进一步退化，从而为正常内皮细胞的结构和功能提供了一个恶劣的，不兼容的环境，导致了光老化皮肤血管的扩张、最终血管减少。PEDF作为目前发现的最强效的内源性血管生成抑制剂，有明确的抗肿瘤作用，还在维持组织稳态，抑制氧化应激、炎性反应和凝血反应中起到重要作用[5]。PEDF在角质层表达明显高于真皮层[6]，而且体外培养的表皮角质形成细胞也有大量的表达[7]。既往对于角质形成细胞分泌VEGF和PEDF的研究[8-9]多集中于银屑病、肿瘤等方面，因为他们参与了角质形成细胞的增殖、血管的新生等，罕见有光老化皮肤血管微循环方面的研究，尚未见报道紫外线照射对PEDF表达的影响。

经查文献[10]和笔者团队的前期研究[11-12]证明了GSPE是一种安全范围广有光保护作用的天然植物提取成分，为了探究其是否能够抵御紫外线照射引起的皮肤血管改变进行了本次研究。实验选取HaCaT细胞为靶细胞，研究UVA照射对皮肤血管生成和抑制因子表达的影响。结果显示UVA照射HaCaT细胞后，会升高VEGF mRNA、降低PEDF mRNA的表达，二者协同最终导致了光老化早期皮肤的毛细血管增多、毛细血管扩张。而加入了GSPE后，可以下调VEGF基因的表达、同时上调PEDF基因的表达，二者协同作用的结果是抑制不稳定的血管新生。证实了GSPE有抗紫外线所致光老化早期血管生成的作用。据此笔者也希望，这种廉价易得的GSPE能够在抵抗光老化方面得到更广泛的应用。