佳木斯地区原发性高血压合并高尿酸血症与MTHFR基因多态性的相关性研究

隋小芳，华玥祺，邹玉敏，苑露丹，费秀斌，刘春辉，黄佳滨，姜秀政，王凤玲*

(1.佳木斯大学附属第一医院 健康管理体检中心，黑龙江 佳木斯154002；2.佳木斯大学研究生部；3.佳木斯大学附属第一医院 消毒供应科；4.佳木斯大学附属第一医院 老年病科)

原发性高血压(Essential hypertension,EH)和高尿酸血症(Hypemricemia,HUA)在全世界范围内都是较为常见的慢性疾病，这两种疾病在我国的患病率呈逐年增加趋势[1,2]。目前对于亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因多态性与疾病的相关性研究多为单种疾病的研究，而EH合并HUA共病的研究较为缺乏。本研究对MTHFR基因多态性与EH合并HUA共病之间的相关性进行了研究，为该基因在EH合并HUA共病诊断和治疗的应用奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本项研究收集2017年6月至2018年7月间，在佳木斯大学附属第一医院就诊及体检中心体检的人群为研究对象，共纳入符合入组标准的受试者共392例，其中EH组109人，HUA组86人，EH合并HUA组95人，健康对照组102人。各组入组人群均为符合相关指南诊断标准的成年人，并签署了知情同意书。

排除标准：痛风患者、肝肾功能不全者、近期服用过氢氯噻嗪等可影响血尿酸药物者、甲亢或甲减患者、孕妇及哺乳期妇女。

1.2 主要实验仪器和试剂

基因组DNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)、限制性内切酶MIuI(北京擎科生物有限公司)、HRM Light Scanner TMHR-I 96仪和LC-greenPLUS饱和荧光染料(美国Idaho公司)、PCR仪C-1000(美国Bio-Rad公司)。

1.3 样本资料采集和DNA制备

记录受试者的性别、年龄、标准化测量的血压、生化指标(尿酸、血浆同型半胱氨酸、空腹血糖等)等资料。此外，在获得受试者的允许后使用标准EDTA抗凝管收集5 ml静脉血，储存于-20℃冰箱。待所有血样集齐后统一提取DNA，使用Nanodrop ND-1000分光光度计进行浓度和纯度的测定，最后将样本DNA的浓度用ddH2O标化至90-120 ng/μL之间，置于4 ℃的环境中保存备用。

1.4 MTHFR 的HRM基因分型

1.4.1设计引物 使用NCBI数据库查询MTHFR C677T SNP位点所在的DNA序列，结合Primer Premier5.0和Oligo6.0软件进行引物设计：上游引物序列：GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG；下游引物序列：CAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGA。

1.4.2PCR反应 PCR扩增选用10 μl体系，按要求配置好后封存待用。PCR的扩增条件为：95 ℃预变性时长3 min；95 ℃变性时长20 s，64.1 ℃复性时长20 s，72 ℃延伸时长4 s，再将第2-4步重复45个循环。

1.4.3PCR扩增产物的HRM分析 PCR流程完成后再72 ℃延伸1 min，95 ℃变性1 min，95℃复性1 min，重复2个循环，将产物移入到专用96孔扫面板中，在离心机内以8 000 rpm的转速离心5 min后取出产物，再将其放入Light Scanner仪中进行高温信号采集。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各组研究对象的一般情况

本研究的4个实验组中研究对象的年龄和性别构成无显著差异，P>0.05。(见表1)

2.2 MTHFR C677TSNP位点哈迪温伯格平衡检验

将各实验组的MTHFR C677T基因多态性分布情况分别进行哈迪温伯格平衡检验，发现本研究所有SNP位点的基因型频率均符合HWE(P>0.05)，说明本研究入组人群具有群体代表性。(见表2)

表1 各实验组研究对象年龄和性别构成的比较

注：P<0.05，有统计学意义。

表2 MTHFR C677T基因多态性的哈迪温伯格平衡分析

注：P>0.05，群体具有代表性。

2.3 各实验组MTHFR C677T基因的基因型和等位基因的分布

2.3.1各实验组 MTHFR C677T基因的基因型和等位基因的分布情况

MTHFR C677T基因多态性的基因型和等位基因在各组的分布情况结果见表3，通过观察我们发现各组中MHTFR C677T基因的CT、TT基因型频率及T等位基因频率均高于对照组，CC基因频率低于对照组。

2.3.2各实验组间MHTFR C677T基因的基因型与等位基因频率的比较在显性模型(CCv.s.CT+TT)中，我们将各组进行两两比较，结果见表3。与对照组相比，EH组CC基因型频率低于对照组(18.63% vs.34.96%)，而CT、TT基因型频率(50.98% 、30.39%)比对照组(44.95% 、20.18%)均高，且差异显著，P=0.008；等位基因T频率(55.88%)显著高于对照组(42.66%)，P=0.007。HUA组CC基因型频率(16.28%)显著低于对照组(34.96%)，其CT、TT基因型显著高于对照组(50%v.s.44.95% ，33.72%v.s.20.18%)，P=0.004；T等位基因频率明显高于对照组(58.72%vs.42.66%)，P=0.002。EH+HUA组CT、TT基因型显著高于对照(51.57%、35.79%v.s.44.95%、20.18%)，CC基因型显著低于对照组(12.63%v.s.34.96%)，P<0.001；T等位基因频率(61.57%)明显高于对照组(42.66%)，P<0.001。而各实验组间比较其差异无统计学意义，P>0.0083。(见表3)

表3 显性模型中各组MTHFR C677T基因的基因型和等位基因频率分布及比较

注：4个组间指标的两两比较，P需经Bonferroni校正法校正，*P<α’=0.05/6=0.0083有统计学意义。

3 讨论

EH及HUA都会增加心脑血管疾病不良事件的发生风险，其存在高患病率、高致残率、低知晓率、低治疗率的现象，使其成为严重影响人们健康的慢性疾病[3,4]，当二者并发时心脑血管疾病发生的风险将大大增加[5-7]。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是人体内促进叶酸代谢的一个重要酶，MTHFR C677T基因有3个基因型，分别为CC、CT和TT，携带TT和CT基因型的人MTHFR酶活性会分别下降70%和30%[8]，从而影响Hcy的代谢，导致HHcy。

近年以来，国内外已对高血压及高尿酸血症的相关基因做了许多研究，但是结果并不一致[9-11]。本研究发现，各实验组中CT、TT基因型频率及T等位基因频率均高于对照组，CC基因频率低于对照组，而在共病及单独疾病中的分布差异无统计学意义。这结果表明MTHFR C677等位基因可增加EH合并HUA、EH和HUA的患病风险，在EH或HUA患者中并不会增加患EH合并HUA共病的风险。EH和HUA均是多基因、多因素共同导致的复杂疾病，单基因研究尚不足以获得阳性结果，需要进一步深入的研究来探讨其他基因多态性、以及基因之间的交互作用是否会导致差异性。有研究显示MTHFR C677T基因检测可用以指导高血压精准治疗并取得更好的降压效果[12,13]。而高尿酸血症与原发性高血压合并高尿酸血症的基因研究指导疾病精准治疗的效果有待继续研究。