miR-381靶向HMGB1抑制子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移

赵临潇，于东升，刘 希，王 雷，左博云

(1.延安大学咸阳医院 病理科，陕西 咸阳712000；2.西安交通大学第一附属医院 病理科，陕西 西安710000)

子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)是常见的妇科癌症，好发于绝经后妇女，以阴道异常出血和绝经后出血为症状，大多数患者可在早期被诊断，预后良好，5年生存率可达80%-85%[1,2]；随着人们生活方式的改变，在肥胖和高血糖等因素影响下，子宫内膜癌的发病率越来越高，也更趋于年轻化[3]。外科手术是EC治疗的主要手段，包括子宫切除术、双侧输卵管及卵巢切除术和淋巴结切除术等，主要取决于子宫颈、卵巢及淋巴结累及程度[2-4]。微小RNA(MicroRNA,miR)是一类在真核细胞中均存在的、内源性、非编码小RNA分子，能负性调控基因表达，进而参与细胞增殖、凋亡、癌变等生物过程[5，6]。既往研究表明，在多种肿瘤组织中，miR-381表达水平明显降低，如乳腺癌、胃癌、胶质瘤和乳头状甲状腺癌[7-10]。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)在肿瘤组织中高表达，能降低癌细胞的放疗敏感性，增加肿瘤细胞的增殖和迁移能力[11-12]。但miR-381与HMGB1的关系及两者对EC的作用鲜有报道。本研究通过上调子宫内膜癌细胞中miR-381表达水平，探讨其对细胞增殖、侵袭和迁移的影响，拟为EC的靶向治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

正常子宫内膜细胞株EM-E6/E7/TERT和子宫内膜细胞癌细胞(Ishikawa、KLE、AN3CA、HEC1A和RL95-2)均购自美国典型培养物保藏中心；胎牛血清(货号：10437028)、DMEM(货号：11965092)、DEME/F-12(货号：11320082)和MEM培养基(货号：11575032)均购自美国Gibco公司；实验所用引物购自上海生工；CCK8试剂盒(货号：C0037)购自碧云天生物技术公司；Trizol(货号：10296028)总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen；E-cadherin(货号：14472)、N-cadherin(货号：4061)、Vimentin(货号：3932)、Ki67(货号：9449)、PCNA(货号：2586)、基质金属蛋白酶-2 (metalloproteinase-2,MMP-2)(货号：4022)、MMP-9(货号：3852)一抗购自美国Cell Signaling Technology，二抗(货号：ab40772、ab18203、ab92547、ab197234、ab29、ab37150、ab38898)购自英国Abcam；Transwell小室(货号：3477)购自美国Costar公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养

将5种子宫内膜癌细胞和正常子宫内膜细胞株分别培养在含有10%胎牛血清的培养基中，在37 ℃、含5% CO2的恒温细胞培养箱中培养。一般2天更换1次培养液，当细胞融合度达到80%时可进行传代。

1.2.2细胞转染

接种细胞待细胞融合至90%，利用Lipofectamine 2000进行转染。细胞在含有10%血清的培养基中于37 ℃、5% CO2条件下培养2 d进行后续实验。

1.2.3实时定量PCR(Quantitative real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR)收集细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，并反转录合成cDNA，之后进行qRT-PCR。反应程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变形10 s，60 ℃退火30 s，35个循环。以β-actin 为内参，按照2-ΔΔCT法计算相对表达量。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.2.4荧光素酶报告实验

采用生物信息学预测软件TargetScan检测发现miR-381和HMGB1存在连续的结合位点，再将HMGB1上该结合位点片段进行扩增，随后克隆至荧光素报告酶载体pcDNA中，构建HMGB1野生型(WT)质粒。再利用基因位点突变技术将结合位点片段中部分核苷酸进行突变，构建HMGB1突变型(MUT)质粒。

将细胞分为4组(HMGB1 WT组、HMGB1 WT+miR-381 mimic组、HMGB1 MUT和HMGB1 MUT+miR-381 mimic组)，作相应转染48 h后，根据试剂盒说明书裂解细胞并测定荧光素酶活性。

1.2.5细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖能力

将细胞分为4组(HEC1A组、miR-381 mimc组、pc-HMGB1组和mimic+pc-HMGB1组)，作相应转染后分别培养24、48和72 h，再加入CCK-8溶液，于37 ℃恒温培养箱中继续培养4 h，最后检测450 nm处吸光值(A)，计算细胞增殖倍数。以HEC1A细胞增殖的倍数来表示其它各组细胞增殖能力。

1.2.6Transwell实验

将1×105个细胞接种于Transwell 小室上层，加入无血清培养基，在小室下层加入含20%胎牛血清的培养基作为化学诱导物，细胞分成4组(HEC1A组、miR-381 mimc组、pc-HMGB1组和mimic+pc-HMGB1组)，于37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱中孵育24 h。取出Transwell小室用棉签小心拭去基质胶及上室细胞，4%多聚甲醛固定10 min，结晶紫室温染色25 min。显微镜下选5个视野进行拍照计数，计算平均每个视野的细胞数。

1.2.7细胞划痕实验

将1×105个细胞接种于培养板中，当细胞融合度达到90%时，用10 μl枪头尽量垂直作线性划痕，吸去培养基，PBS洗涤去除脱落细胞，加入无血清培养基培养，细胞分成4组(HEC1A组、miR-381 mimc组、pc-HMGB1组和mimic+pc-HMGB1组)，继续培养24 h后取出细胞培养板，拍照记录并测量划痕宽度。划痕闭合率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.2.8Western blot检测相关蛋白表达水平

将1×105个细胞接种于培养板中，细胞分成4组(HEC1A组、miR-381 mimc组、pc-HMGB1组和mimic+pc-HMGB1组)，培养细胞48 h后，用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法检测蛋白质浓度并调平，每组取30 μg蛋白用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离蛋白并转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上，再用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗(1∶500)于4 ℃封闭过夜。第2天洗膜后加入二抗(1∶2 000)室温孵育1 h后，加入显色液曝光显影。

1.2.9统计学方法

2 结果

2.1 miR-381在正常子宫内膜细胞株和癌细胞系中的差异表达

与正常子宫内膜细胞株相比，miR-381在5个子宫内膜癌细胞系中均存在低水平表达(P<0.01),见图1。

图1 miR-381表达水平

2.2 HMGB1是miR-381的直接靶点

生物信息学预测结果发现，miR-381-3p序列与HMGB1的3′-UTR端第358-364位点存在连续的互补片段(图2A)。为了验证两者的靶向关系，采用荧光素酶报告实验进一步确定，结果发现，与HMGB1 WT组相比，HMGB1 WT+miR-381mimic组荧光素酶活性明显降低(P<0.01，图2B)，而HMGB1 MUT组和HMGB1 MUT+miR381 mimic荧光素酶活性无明显改变(P>0.05，图2B)。

图2 miR-381与HMGB1具有靶向关系

注：与HMGB1 WT组比较，**P<0.01。A：miR-381与HMGB1生物信息学预测结果；B：荧光素酶报告实验证明miR-381与HMGB1存在靶向关系。

2.3 miR-381靶向抑制HMGB1表达

与HEC1A组相比，转染miR-381 scramble后miR-381表达水平未见明显改变(P>0.05，图3A)，而转染miR-381 mimic可显著增加miR-381在HEC1A细胞中的表达水平(P<0.01，图3A)；此外，转染miR-381 mimic后，HMGB1的mRNA表达水平在HEC1A细胞中显著降低(P<0.01，图3B)。

蛋白印迹实验结果表明，与HEC1A组相比，miR-381 mimic组HMGB1蛋白表达水平显著降低(P<0.01，图3C和3D)，pc-HMGB1组其表达则显著增加(P<0.01，图3C和3D)；而与pc-HMGB1组相比，mimic+pc-HMGB1组HEC1A细胞中HMGB1蛋白表达水平得到部分逆转(P<0.01，图3C和3D)。

2.4 miR-381靶向HMGB1抑制HEC1A细胞增殖

图3 miR-381 mimic对HMGB1表达水平的影响

注：与HEC1A组比较，**P<0.01；与pc-HMGB1组比较，##P<0.01。A：miR-381表达水平；B：HMGB1的mRNA表达水平；C：HMGB1蛋白条带图；D：HMGB1的蛋白表达水平。

CCK8实验检测miR-381靶向HMGB1对HEC1A细胞增殖能力的影响，结果显示：与HEC1A组相比，miR-381 mimic组细胞增殖倍数显著降低(P<0.01，图4A)，pc-HMGB1组细胞增殖倍数则显著增加(P<0.01，图4A)；与pc-HMGB1组相比，mimic+pc-HMGB1组细胞增殖倍数降低(P<0.01，图4A)。此外，蛋白印迹实验进一步检测影响HEC1A细胞增殖能力的分子机制，结果显示：与HEC1A组相比，miR-381 mimic组增殖相关蛋白Ki67和PCNA表达水平显著降低(P<0.01，图4B和4C)，pc-HMGB1组两种蛋白表达水平则显著增加(P<0.01，图4B和4C)；与pc-HMGB1组相比，mimic+pc-HMGB1组细胞中Ki67和PCNA表达水平降低(P<0.01，图4B和4C)。

图4 HEC1A细胞增殖倍数和相关蛋白表达

注：与HEC1A组比较，**P<0.01；与pc-HMGB1组比较，##P<0.01。A：HEC1A细胞增殖倍数；B：增殖相关蛋白条带；C：增殖相关蛋白表达结果。

2.5 miR-381靶向HMGB1抑制HEC1A细胞侵袭迁移和上皮间质转化

Transwell实验和划痕闭合实验分别检测miR-381靶向HMGB1对HEC1A细胞侵袭迁移能力的影响，结果显示：与HEC1A组相比，miR-381 mimic组侵袭细胞数量和划痕闭合率均显著降低(P<0.01，图5A和5B)，pc-HMGB1组侵袭细胞数量和划痕闭合率则均显著增加(P<0.01，图5A和5B)；与pc-HMGB1组相比，mimic+pc-HMGB1组侵袭细胞数量和划痕闭合率均降低(P<0.01，图5A和5B)。此外，蛋白印迹实验检测影响HEC1A细胞侵袭迁移和EMT能力的分子机制，结果显示：与HEC1A组相比，miR-381 mimic组细胞低表达N-cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9而高表达E-cadherin(P<0.01，图5C)，pc-HMGB1组则高表达N-cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9而低表达E-cadherin(P<0.01，图5C)；与pc-HMGB1组相比，mimic+pc-HMGB1组5中蛋白表达水平均全部逆转(P<0.01，图5C)。

3 讨论

在世界范围内，EC均是最常见妇科恶性肿瘤，在我国发病率仅次于宫颈癌；目前，临床上对绝经后阴道出血的妇女需经阴道超声检查，评估子宫内膜厚度以决定内膜活检的必要性，通常以5 mm为标准，但对无症状子宫内膜增厚患者并不适用[13]。目前，EC的早期筛查和诊断依然存在困难，其治疗主要以手术切除为主，但为了保留生育能力，保守治疗仍是年轻女性的选择之一。因此，寻找新的非手术治疗方法是非常必要的。miRNAs是一种高度保守的非编码RNA，长度约为18-22个核苷酸，在转录后水平上可负向调控目的基因表达[14]。大量研究均表明，miRNAs在子宫内膜癌发展进程中发挥着重要作用，可通过靶向调节目的基因实现抑制或促进癌细胞生长[15-18]。且研究发现，HMGB1与EC发展呈负相关，抑制HMGB1表达能降低EC发生EMT转变，从而阻止癌细胞的侵袭和转移[19]。基于此，本研究首先检测了miR-381在正常子宫内膜细胞和多种子宫内膜癌细胞系的表达差异，确定其在子宫内膜癌细胞中低表达。之后，通过生物信息学预测miR-381和HMGB1的靶向关系并采用荧光素酶报告实验加以证实。证明，miR-381过表达能靶向抑制HMGB1的mRNA和蛋白表达水平。

既往研究表明，miR-381可抑制癌细胞的增殖水平，如miR-381靶向成纤维细胞因子II型受体基因，从而抑制口腔鳞状细胞癌的增殖能力[20]。Ki67和PCNA均是存在于增殖细胞核中的核蛋白，两者高表达是细胞处于增殖水平的标记[21,22]。本实验研究发现，过表达miR-381抑制HEC1A细胞的增殖倍数，同时降低细胞内增殖相关蛋白Ki67和PCNA的蛋白表达水平，而共同转染miR-381 mimic和pc-HMGB1部分逆转了上述表现。综合实验结果表明，过表达miR-381对HEC1A细胞增殖能力的抑制作用，可能是通过靶向抑制HMGB1表达有关。而Tu等人[23]则认为miR-381抑制子宫内膜癌细胞增殖的作用，是通过靶向抑制胰岛素样生长因子受体1(insulin-like growth factor receptor 1,IGF-1R)实现的。

图5 HEC1A细胞侵袭、迁移能力和相关蛋白表达

注：与HEC1A组比较，**P<0.01；与pc-HMGB1组比较，##P<0.01。A：Transwell实验检测HEC1A细胞侵袭能力；B：划痕实验检测HEC1A细胞迁移能力；C：蛋白印迹实验检测相关蛋白表达水平。

此外，miR-381可抑制癌细胞的侵袭、迁移和上皮间质转化，如增加miR-381表达可通过靶向调控Twist1而抑制结肠癌细胞的侵袭与迁移[24]；而靶向CXC 趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)能抑制乳腺癌细胞上皮间质转化和转移[1]。当肿瘤细胞发生EMT时，上皮标记蛋白E-cadherin的表达明显下调，而间质标记蛋白N-cadherin和Vimentin的表达则明显上升[25]。此外，MMP-2和MMP-9在肿瘤侵袭转移过程中起着重要作用，有利于肿瘤细胞侵袭转移的发生[26]。本实验研究发现，过表达miR-381能抑制HEC1A细胞的侵袭和迁移能力，同时调节侵袭、迁移和EMT相关蛋白表达水平，而过表达HMGB1则正好相反，且共同转染miR-381 mimic和pc-HMGB1部分逆转了过表达HMGB1对肿瘤细胞侵袭、迁移和EMT的影响。综合实验结果显示，miR-381可能通过靶向抑制HMGB1表达水平，从而抑制HEC1A细胞的侵袭、迁移和EMT能力。但是，过表达miR-381对子宫内膜癌细胞的抑制作用是否还存在其他靶基因的表达改变，还需要进一步筛查和研究。

综上所述，HMGB1是miR-381的直接靶点；过表达miR-381能抑制HMGB1的mRNA和蛋白表达水平；抑制细胞增殖能力和相关蛋白Ki67、PCNA的表达；降低细胞侵袭、迁移能力，并调节相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9的表达。表明，miR-381的表达上调通过靶向调控HMGB1的表达，抑制了子宫内膜癌HEC1A细胞的增殖、侵袭和迁移。下一步将研究过表达miR-381靶向HMGB1对子宫内膜癌细胞的体内生长和转移作用，以期为子宫内膜癌的治疗提供思路。