长链非编码RNA结肠癌相关转录物2(CCAT2)在膀胱癌中的表达及作用机制

刘 明，陶思行，谭九峰，陈晓亮，晋学飞，王传芳，那万里

(1.四平市中心人民医院，吉林 四平136000；2.吉林大学中日联谊医院；3.榆树市中医院)

膀胱癌是常见的泌尿系肿瘤，在我国有较高的发病率[1]。膀胱癌的治疗以手术切除为主，并辅以放疗、化疗，但5年生存率仍不尽如人意[2]。对膀胱癌发病机制不明确是导致其治疗效果不佳的主要原因。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度超过200 核苷酸的不编码蛋白质的RNA，其可在基因组转录水平、基因组转录后水平及表观遗传学等层面调控基因表达，进而参与恶性肿瘤的发生与发展[3]。lncRNA结肠癌相关转录物2(CCAT2)是位于人类染色体8q24的lncRNA，最早发现于结肠癌中，并被证实可促进结肠癌的增殖和迁移[4]。近年来研究发现，CCAT2在多种恶性肿瘤中都发挥重要调控作用，如前列腺癌[5]、非小细胞肺癌[6]、胃癌[7]等。但CCAT2与膀胱癌的相关研究未见报道。本研究旨在观察CCAT2在膀胱癌中的表达，并通过干预CCAT2表达研究其对膀胱癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响，以期为膀胱癌的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本采集选取2018年1月至2018年12月我院行手术切除的50例膀胱癌患者癌组织样本和癌旁组织样本(距离肿瘤组织边缘>5 cm)，患者术前均未接受放化疗治疗。本研究经医院伦理学委员会审批通过，患者均签署知情同意书。

1.2 细胞系和主要试剂人正常膀胱上皮细胞sv-HUC-1、膀胱癌细胞株EJ、BIU87、T24、T24-ADM购于美国ATCC；DMEM培养基、PBS缓冲液、胰蛋白酶、胎牛血清购于Hyclone公司；RT-PCR试剂、Bax单克隆抗体、Bcl-2单克隆抗购于大连Takara公司；Western blot试剂盒购于南京建成生物有限公司；LipofectamineTM 2000脂质体转染试剂购于Invitrogen公司；CCK8试剂盒购于碧云天试剂有限公司。

1.3 细胞培养与转染常规复苏细胞，用含有10%胎牛血清+1%双抗的DMEM培养液重悬浮细胞，并置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每天换液1次。收集对数生长期的细胞，接种于细胞培养板中，细胞浓度为2×106cells/孔，采用LipofectamineTM 2000用siRNA-NC、siRNA-CCAT2对细胞进行转染，细胞置于于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。

1.4 qRT-PCR检测CCAT2表达参照Trizol试剂盒说明书提取组织/细胞中总RNA，利用反转录试剂盒逆转录总RNA至cDNA，以此cDNA为模板并根据SYBR Premix ExTaqTM说明书行qRT-PCR，用公式2-△△CT计算CCAT2的相对表达。CCAT2引物序列：上游5’-CCCTGGTCAAATTGCTTAACCT-3’，下游5’-TTATTCGTCCCTCTGTTTTATGGAT-3’；GAPDH引物序列：上游5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’，下游5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’。

1.5 CCK-8检测细胞增殖收集转染后细胞，并接种于96孔板中，细胞终浓度为2×106cells/孔，分别培养24 h、48 h、72 h、96 h时，弃去细胞培养液，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，孵育10 min，用全自动酶标仪测定波长OD450 nm处光密度值。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡收集转染后细胞，将细胞置于37℃、5% CO2条件中继续培养48 h，采用凋亡试剂盒(Annexin-V/PI)进行避光染色，1 h后上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。细胞凋亡率=[(右上象限细胞+右下象限细胞)/总细胞数]×100%。

1.7 划痕实验检测细胞迁移收集转染后细胞，将细胞置于37℃、5% CO2条件中继续培养，待细胞融合率达到90%左右时，用200 μl枪头垂直于6孔板底部做横线划痕，之后细胞继续置于恒温培养箱(37℃、5% CO2)中培养，培养后24 h，于倒置光学显微镜下拍照(×100)观察，利用Image J软件测量划痕区域宽度，并计算细胞划痕愈合率。

1.8 Western blot法检测凋亡相关蛋白表达收集转染后细胞，蛋白提取试剂盒提取细胞蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测样品蛋白浓度，取200 μl样品行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，4℃封闭4 h，后依次加入1∶2 000浓度I抗(兔抗人Bcl-2和兔抗人Bax)、1∶500浓度HRP标记的羊抗兔II抗，按ECL试剂盒说明书行电化学发光检测。

1.9 统计学方法采用SPSS20.0分析数据，计量资料用均值±标准差表示，多组间比较用单因素方差检验，两两间比较用LSD-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CCAT2在膀胱癌组织及细胞中的表达分析

CCAT2在膀胱癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05)(见图1A)；与sv-HUC-1细胞比较，CCAT2在EJ、BIU87、T24、T24-ADM细胞中的表达明显增高(P<0.05)，其中以EJ、BIU87细胞最高(见图1B)。

2.2 转染siRNA-CCAT2对膀胱癌细胞中CCAT2表达的影响

图1A 膀胱癌组织及癌旁组织中CCAT2表达水平比较 图1B 正常膀胱细胞及膀胱癌细胞中CCAT2表达水平比较

注：与癌旁组织比较，***P<0.05 注：与正常膀胱细胞比较，***P<0.05

选取CCAT2表达水平最高的两株膀胱癌细胞EJ、BIU87为对象，并分别转染转染siRNA-NC和siRNA-CCAT2，采用qRT-PCR检测细胞中CCAT2表达。与转染siRNA-NC相比较，转染siRNA-CCAT2后细胞中CCAT2表达显著降低(P<0.05)(见图2)。

2.3 转染siRNA-CCAT2对膀胱癌细胞增殖的影响

CCK8结果显示：与转染siRNA-NC相比较，转染siRNA-CCAT2后EJ、BIU87细胞增殖活性均显著降低(P<0.05)(见图3A、3B)。

2.4 转染siRNA-CCAT2对膀胱癌细胞凋亡的影响

流式结果显示：与转染siRNA-NC相比较，转染siRNA-CCAT2后EJ、BIU87细胞凋亡率均显著增高(P<0.05)(见图4)。

图2 转染siRNA-CCAT2对膀胱癌细胞中CCAT2表达的影响

注：与转染siRNA-NC比较，***P<0.05

图3A转染siRNA-CCAT2对EJ细胞增殖的影响 图3B 转染siRNA-CCAT2对BIU87细胞增殖的影响

注：与转染siRNA-NC比较，***P<0.05 注：与转染siRNA-NC比较，***P<0.05

2.5 转染siRNA-CCAT2对膀胱癌细胞迁移的影响

流式结果显示：与转染siRNA-NC相比较，转染siRNA-CCAT2后EJ、BIU87细胞迁移能力均显著减弱(P<0.05)(见图5)。

2.6 转染siRNA-CCAT2对膀胱癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响

流式结果显示：与转染siRNA-NC相比较，转染siRNA-CCAT2后EJ、BIU87细胞Bcl-2蛋白表达显著减少，而Bax蛋白表达显著增高(P<0.05)(见图6)。

图4 转染siRNA-CCAT2对EJ、BIU87细胞凋亡的影响

图5 转染siRNA-CCAT2对EJ、BIU87细胞迁移的影响

图6A转染siRNA-CCAT2对EJ细胞凋亡相关蛋白表达的影响 图6B转染siRNA-CCAT2对BIU87细胞凋亡相关蛋白表达的影响

注：与转染siRNA-NC比较，***P<0.05 注：与转染siRNA-NC比较，***P<0.05

3 讨论

lncRNAs与癌症密切相关。膀胱癌中存在多种lncRNAs的异常表达，如ZFAS1[8]、H19[9]、HOTAIR[10]等，对膀胱癌的发生发展起着重要作用。CCAT2是近年来新发现的一类lncRNA。Qiu等[11]研究发现，CCAT2在非小细胞肺癌组织中表达显著高于癌旁正常组织，平均上调7.5倍。Huang等[12]研究证实，CCAT2在卵巢癌组织和细胞系中均呈高表达，CCAT2高表达者其总体生存期明显短于低表达者(P<0.05)，且CCAT2表达与FIGO分期、肿瘤分级及远处转移呈正相关。本研究中，我们通过观察膀胱癌组织和细胞系中CCAT2表达变化发现，CCAT2在膀胱癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05)，且多株膀胱癌细胞中CCAT2表达均明显高于膀胱正常上皮细胞(P<0.05)。上述结果表明，CCAT2在包括膀胱癌在内的多种恶性肿瘤中呈高表达，其表达上调与肿瘤发生发展密切相关。

为进一步验证CCAT2在膀胱癌中的作用，我们选取了CCAT2表达量最高的两株膀胱癌细胞EJ、BIU87为对象，观察沉默CCAT2对细胞增殖、迁移及凋亡的影响。结果发现：与转染siRNA-NC相比较，转染siRNA-CCAT2可使得膀胱癌细胞中CCAT2表达明显下调，同时显著抑制细胞增殖活性及细胞迁移能力(P<0.05)，表明CCAT2高表达是促使膀胱癌细胞增殖和迁移的主要原因之一。类似现象，也已在肝癌[13]、胶质瘤[14]中得到证实。流式结果显示，转染siRNA-CCAT2后膀胱癌细胞凋亡率明显提高，与转染siRNA-NC相比差异显著(P<0.05)，表明CCAT2是一种膀胱癌细胞生长正调控因子，扮演着“促癌基因”作用，这与CCAT2在其他肿瘤中的作用相一致[15，16]。因此，深入研究CCAT2促进膀胱癌细胞生长机制对于膀胱癌的防治具有重要意义。

凋亡过程的启动与细胞的“命运”息息相关，而Bcl-2/Bax比值是启动细胞凋亡的“分子开关”。Bcl-2、Bax是凋亡网络中的核心蛋白，其中Bcl-2具有抑制细胞凋亡作用，而Bax则可促进细胞凋亡。Bcl-2/Bax比值决定了异二聚体(Bcl-2/Bax)与同二聚体(Bax/Bax)的比值，是反映细胞凋亡水平的重要指标[17]。当Bcl-2过度表达或Bax表达降低，则易形成Bcl-2/Bax异二聚体，从而抑制细胞凋亡；反之，当Bcl-2表达下调或Bax表达增高，则可形成Bax/Bax同二聚体，诱导细胞凋亡发生[18]。本研究结果显示，与转染siRNA-NC相比较，转染siRNA-CCAT2后膀胱癌细胞Bcl-2蛋白表达显著减少，而Bax蛋白表达显著增高(P<0.05)。上述结果提示，沉默CCAT2可下调Bcl-2表达，同时上调Bax表达，使得Bcl-2/Bax比值降低，而这也是其促进膀胱癌细胞凋亡的可能机制之一。

综上所述，CCAT2在膀胱癌组织和细胞中高表达，沉默CCAT2可抑制膀胱癌细胞增殖和迁移，并促进膀胱癌细胞凋亡，其机制可能与调控Bcl/Bax比率有关。