以叶酸为靶向分子担载紫杉醇纳米颗粒对肝癌细胞生物学行为的影响

赵 航，赵启明，王 蒙

(长春市中心医院 普外科，吉林 长春130051)

目前手术切除、肝移植、介入、射频消融等方法为肝脏肿瘤治疗常用手段，化学药物治疗(如阿霉素、铂类药物等)亦是最主要的有效手段之一。但是，由于化疗药物本身或者药物溶媒显著的毒副作用，以及肿瘤细胞对化疗药物的耐受现象不断出现，化疗很难达到理想效果。紫杉醇(Paclitaxol，商品名 Taxol，略作 PTX)是用于治疗肝癌的一线化疗药物，但是由于其水溶性差，临床用市售紫杉醇注射液多以聚氧乙烯蓖麻油/无水乙醇(体积比 1∶1)混合液作为溶剂。无论是紫杉醇本身还是溶剂都能引起严重过敏、溶血、神经毒性等不良反应，限制了药物发挥疗效。临床化疗迫切要求提高紫杉醇药物的生物利用率，减少其对机体的毒副作用[1-3]。本研究设计并制备以叶酸为靶向分子担载紫杉醇纳米颗粒，使药物特异性地被肿瘤细胞内吞，实现键合抗肝肿瘤药物靶向控制释放，提高药物疗效。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

空聚合物载体(PEG-b-PLA，简称为M)、紫杉醇(PTX)、高分子键合紫杉醇胶束(M(PTX))及叶酸靶向紫杉醇胶束(FA-M(PTX))均由中国科学院长春应用化学研究所提供；DMEM培养基、胎牛血清、胰酶(Gibco)，CCK-8细胞增殖检测试剂盒、AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；YXQ-LS-18SI高压蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司)、FACSCalibur流式细胞仪(BD公司)、DMI3000B倒置荧光显微镜(Leica公司)。

1.2 细胞系 人肝癌细胞HepG2购自中国科学院细胞库。

1.3 方法

1.3.1细胞培养 取对数生长期肝癌细胞，调整细胞浓度为4×104个/mL，接种于96孔板。各孔分别加入100 μl细胞悬液，常规培养18-20 h。待细胞贴壁，小心吸弃培养基，加入200 μl含有浓度分别为 100、10、1.0、0.1、0.01 μg/mL的空聚合物载体(PEG-b-PLA，简称为M)培养基溶液，或PTX质量浓度为10、1、0.1、0.01 μg/mL的紫杉醇(PTX)、高分子键合紫杉醇胶束(M(PTX))和叶酸靶向紫杉醇胶束(FA-M(PTX))的培养基溶液，以仅加入200 μl培养基为阴性对照组。

1.3.2CCK-8法检测细胞活性 将上述各组每一个处理孔设3个复孔，于37℃、5% CO2孵箱中分别培养 24 h、48 h、72 h后取出各板。小心吸弃培养基，每孔再加入新鲜的含10% CCK-8溶液的培养基，培养2 h后，酶标仪在450 nm处测得吸光度(OD值)，并计算药物对细胞增殖的抑制率：细胞增殖抑制率(%) = (1-实验组OD值/对照组OD值) ×100%。

1.3.3Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡 调整细胞浓度为5×104个/mL，1000 rpm离心5 min，小心吸弃培养基，分别加入含PTX质量浓度为10 μg/mL的PTX、M(PTX)、FA-M(PTX)的培养基 2 ml，培养 72 h。以加入单纯培养基的孔为空白对照孔，每组设3个复孔。72 h后在每组细胞悬浮液中加入195 μl Annexin V-FITC结合液，重悬细胞后，再加入5 μl Annexin V-FITC染液和10 μl PI染液，小心混匀。避光室温反应10 min，行流式细胞术检测。用未染色的肝癌细胞悬液调零，以Annexin V-FITC单染管及PI单染管作为基准参照。

1.4 统计学处理

数据分析处理采用 SPSS18.0统计软件，多组比较采用单因素ANOVA方差分析。P<0.05视为差别显著，有统计学意义。

2 结果

2.1 高分子键合胶束对肝癌细胞形态的影响

见图1。倒置显微镜下于72 h观察对照组及经含有不同浓度的高分子键合胶束作用的肝癌细胞。结果表明，FA-M本身对细胞的生长无影响，故不影响后续紫杉醇胶束的作用效果评价。而PTX、M(PTX)和FA- M(PTX)组肝癌细胞数量有所减少。

2.2 高分子键合胶束对肝癌细胞活性的影响

体外培养的肝癌细胞经不同浓度的聚合物胶束M和FA-M分别作用 24 h、48 h、72 h后，经CCK-8法检测，发现作用浓度为1.0 μg/mL时抑制率最大(2.63%)。而高浓度和低浓度的聚合物胶束M和FA-M对细胞的抑制率基本一致，无明显差异。显示出空胶束载体PEG-b-PLA和导向物叶酸并无明显时间或剂量依赖的增殖抑制作用，见表1。

在作用24 h时，10 μg/mL高浓度的PTX、M(PTX)和FA- M(PTX)胶束对肝癌细胞的抑制作用没有显著性差异；药物浓度稀释10倍后，FA- M(PTX)胶束对肝癌细胞的抑制作用显著低于PTX(P<0.05)；进一步稀释达到0.1 μg/mL时，M(PTX)和FA- M(PTX)胶束对肝癌细胞的抑制作用均显著低于PTX(P<0.05)；药物浓度低于0.001 μg/mL时，对癌细胞的抑制率作用微弱。在作用48 h时，10 μg/mL高浓度的M(PTX)胶束对肝癌细胞的抑制作用显著低于同浓度的PTX(P<0.05)。当药物浓度稀释10倍至1 μg/mL及以下浓度时，M(PTX)和FA-M(PTX)胶束对肝癌细胞的抑制作用均显著低于PTX(P<0.05)；当药物浓度低于0.1 μg/mL及以下时，M(PTX)胶束对癌细胞的抑制率也显著低于FA-M(PTX)胶束(P<0.05)。当药物继续作用癌细胞达72 h时，对癌细胞的抑制程度与48 h时相似。结果表明，这3种药物对肝癌细胞均有抑制作用，并且随着药物浓度的增加及作用时间的延长，对细胞生长的抑制率明显增强，见表2。

图1 高分子键合胶束对肝癌细胞形态的影响

表1 聚合物胶束 PEG-b-PLA 对肝癌细胞的抑制作用

表2 高分子键合胶束对肝癌细胞活性的影响

▲P<0.05,compare with PTX group of the same condition;★P<0.05,compare with M(PTX) group of the same condition

2.3 高分子键合胶束对肝癌细胞凋亡的影响

经Annexin V-FITC/PI双染检测观察，药物含 PTX质量浓度为10 μg/mL时，作用72 h抑制率较稳定，故选择该浓度及时间点进行细胞凋亡检测。如图2所示，PTX、M(PTX)和FA-M(PTX)3种药物(PTX质量浓度皆为10 μg/mL)处理72 h的细胞凋亡率与对照组比较有显著差异(P<0.05)。

3 讨论

肝脏是人体合成,代谢、分解大量物质的重要器官。我们国家病毒性肝炎肝硬化后肝癌的发病率特别高，所以能够精准的作用于肿瘤细胞并且又能很好的保护正常的肝脏细胞的药物的靶向问题是肝脏疾病研究的首要课题。

本实验证明应用无毒而又安全的高分子材料作为载体，能够提升肝脏肿瘤治疗效果实现癌变组织的靶向和控制释放。FA-M(PTX)在肿瘤组织周围聚集，提高药物的能效以叶酸为靶向分子担载抗癌药紫杉醇纳米颗粒可以实现肝脏肿瘤的靶向控制释放，使药物被肿瘤细胞特异性吞噬，提高药物的作用效果。比较键合药物和靶向分子理化特性对肝癌组织靶向释放效果与生物学活性来研究药物输送的关键因素，达到键合抗肿瘤药物肿瘤组织的靶向控制释放[1-4]。这种高分子载药纳米粒子具有EPR效应，可以被动靶向给药同时又具有主动肿瘤靶向性。

图2 Annexin V-FITC/PI双染检测肝癌细胞的凋亡

但抗肿瘤高分子纳米药物在应用及进一步研究中还存在许多问题，比如在药物代谢动力学方面研究深度不够；对于影响癌细胞靶向机理的关键因素还缺少更加系统性的研究。虽然在高分子纳米抗肿瘤药物在一定程度上具有靶向性，但效果并不够显著[5-7]。靶向肿瘤的药物输送是机体十分复杂的过程，纳米载体要克服生物屏障才能够实现成功的输送；要实现高效富集于癌细胞中需要在血液系统中存留较长时间，快速进入肿瘤细胞并到达肿瘤细胞药物快速释放都是我们继续研究的方向[7，8]。最终提高治愈率降低化疗药物的副作用，延长癌症患者的生命。