响应面法优化超声辅助提取六神曲中总黄酮的工艺研究*

河北中医学院 河北省中药炮制技术创新中心

郭 梅 木盼盼 安 琪 薛紫鲸 郭 龙 郑玉光 张 丹 (石家庄 050200)

提要 目的：研究响应面法优化超声辅助提取六神曲中总黄酮的工艺条件。方法：以六神曲为原料，以总黄酮提取率为响应值，通过单因素法考察提取时间、料液比和溶剂浓度对六神曲提取效果的影响。根据Box-Behnken原理，采用3因素3 水平响应面试验设计进行优化。结果：溶剂浓度对六神曲的提取效果影响最大，其次是提取时间和药材重量。响应面法优化得六神曲中总黄酮超声提取工艺的最适条件为：超声时间28 min、乙醇浓度 77%、料液比13 g : 30 mL，在此条件下六神曲中总黄酮提取率为0.046%，模型预测值为0.049%，二者相对偏差小于5%。结论：方程拟合良好，说明响应面优化所得的六神曲提取工艺稳定、可行。

六神曲MassaMedicataFermentata，又名神曲，被誉为中药第一曲，是一味传统曲剂类中药。由赤小豆、苦杏仁、青蒿、苍耳草、辣蓼配以带麸面粉按一定比例混合自然发酵制成，[1]具有健脾开胃并有发散作用。[2]由于炮制人员的水平和经验参差不齐，使不同产地和不同批次的六神曲的质量存在很大差异。目前神曲的鉴别方法主要通过其外观性状、粉末显微特征的比较分析，缺乏量化的质量评价方法，[3]且《中国药典》2015版未收载。关于六神曲化学成分的研究报道比较少，其主要含有酵母菌、酶类、维生素B复合体、麦角固醇、挥发油、苷类、黄酮类成分等。[4]黄酮类化合物是植物界广泛存在的一种天然活性成分，具有血管扩张、抗氧化和抗癌等作用。目前，六神曲质量标准研究多集中在黄酮类成分，[5]辣蓼和苍耳中含有芦丁和槲皮素，均具有抗炎止血和抑菌的功效，[6-7]与六神曲的功效具有一定的相关性。

响应面法起源于20世纪70年代，主要应用于食品药品工业。[8]近年来，将此法应用于中药提取工艺的优化成为一种趋势。[9-13]其通过模拟多个变量间的函数关系，建立因素与响应值之间的多元二次回归方程，得到最佳提取条件。故本实验利用Box-Behnken响应面法优化六神曲中总黄酮超声辅助提取工艺的最佳条件，为六神曲的深入研究及开发利用提供参考。

1 材料与仪器

紫外可见分光光度计(UV-2600，岛津仪器有限公司)；KQ-300VDE型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BSA224S-CW电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。六神曲(安国药材市场)，芦丁对照品(成都昂赛思生物科技有限公司，批号：170426)；无水乙醇(分析纯AR，天津欧博凯化工有限公司)；水为自制一级超纯水。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 六神曲粉碎，过40目筛，精密称定六神曲粉10 g，置于100 mL的锥形瓶中，精密加入30 mL适宜浓度的乙醇，在一定条件下超声提取，摇匀，13 000 r/min离心10 min，取上清液，即得供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备 精密称定芦丁10 mg，置于25 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至25 mL，即得芦丁母液。

2.3 六神曲中总黄酮含量测定 采用NaNO2-Al(NO3)3显色法，取提取液3 mL加至25 mL容量瓶中，然后再加入1 mL的NaNO2(5%)溶液摇匀，室温下静置6 min，使其充分反应；加入1 mL的Al(NO3)3(10%)溶液摇匀，室温下静置6 min，使其充分反应；加入10 mL 1 mol/L的NaOH溶液，加入适宜浓度的乙醇定容至25 mL，静置15 min，使其充分反应。用紫外-分光光度计在500 nm处测定吸光度。

2.4 总黄酮提取率 总黄酮提取率(%)= C×V×N/(1 000×m)×100，其中，C是样品溶液中总黄酮的质量浓度(mg/100 mL)，V是样品溶液的体积，N是样品溶液稀释的倍数，m是样品的重量(g)。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察：依次精密量取1、2、3、4、5、6 mL芦丁母液至于25 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至25 mL，作为不同质量浓度的芦丁对照品溶液(空白：不加芦丁对照品溶液)。用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法进行显色，用紫外-分光光度计在波长500 nm处测吸光度。以标准溶液浓度(mg/100 mL)为横坐标(x)，吸光值为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.114 2x+0.004 2(r=0.999 6)，表明在0.32 mg/100 mL～16 mg/100 mL浓度范围内线性关系良好。

2.5.2 精密度试验：精密量取对照品溶液，按照“线性关系考察”项下，一次连续测定6次，RSD为0.052%，表明本仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验：利用响应面法得到的最佳提取条件制备供样品溶液1份，于室温下放置0、3、6、12、24、48 h，按2.3项下方法显色，以提取率为指标进行分析。结果RSD值为0.099%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.5.4 重复性试验：利用响应面法得到的最佳提取条件制备样品溶液6份，按2.3项下方法显色，以提取率为指标进行分析。结果RSD值为0.053%，表明此方法重复性良好。

2.6 单因素试验

2.6.1 超声时间对六神曲提取效率的影响：按照2.1项下方法，称取六神曲药材粉末10 g，以30 mL无水乙醇为提取溶剂，提取温度为35℃，以考察提取时间10、20、30、40 min对六神曲中总黄酮提取率的影响，结果见图1。随着时间的延长，六神曲总黄酮提取率逐渐增高，且在30 min处达到最高值；超声30 min后，提取率不断下降。推测其原因，开始在超声作用下，随着时间延长提取液中总黄酮物质不断析出，但是如果时间过长，超声波处理则会导致糖类等成分溶出增加，体系黏性增加进而导致六神曲总黄酮提取率降低。故选择30 min为最优超声时间，此时六神曲中总黄酮的提取效果最优。

图1 提取时间对六神曲总黄酮提取率的影响

2.6.2 溶剂浓度对六神曲提取效率的影响：按照2.1项下方法，称取六神曲药材粉末10 g，提取温度为35℃，提取时间为30 min，以30 mL不同体积分数的乙醇为提取溶剂，以考察溶剂浓度40%、60%、80%、100%对六神曲总黄酮提取率的影响，结果见图2。当不断加大溶剂质量分数时，六神曲中总黄酮提取率迅速增高，在体积分数达到80%时，其提取率达到最大值，但之后随溶剂质量分数的增加，提取率不断下降。推测其原因可能是当乙醇浓度过高或过低时，导致溶剂的极性偏大或偏小，使得六神曲总黄酮提取率降低。故选择80%为乙醇最优浓度，此时对六神曲中总黄酮提取效果最优。

图2 溶剂浓度对六神曲总黄酮提取率的影响

2.6.3 料液比对六神曲提取效率的影响：按照2.1项下方法，称取一定量的六神曲药材粉末，以30 mL无水乙醇为提取溶剂，超声时间为30 min，提取温度为35℃。以考察药材重量4、8、12、16 g对六神曲中总黄酮提取率的影响。结果见图3。随着药材重量加大时，六神曲中总黄酮提取率逐渐增高；当药材重量达到12 g时，总黄铜提取率达到最高值，随后加大药材重量，提取率下降，说明当药材重量为12 g，提取溶剂为30 mL时，样品中总黄酮基本已经被全部提出，六神曲中总黄酮提取率不会随着药材重量的增加而增大，继续增大药材重量，其溶出量的变化不明显，但消耗溶剂量明显增加，同时去除溶剂负荷增加。故选择12 g为药材最优重量，即料液比12∶30 (g/mL) 最优。此时对六神曲中总黄酮提取效果最优。

图3 药材重量对六神曲总黄酮提取率的影响

2.7 响应面优化试验设计 在单因素分析的基础上，利用Box-Behnken的中心组合原理，以提取时间(A)、药材重量(B)、溶剂浓度(C)为自变量，六神曲总黄酮提取率为因变量，采用3因素3水平响应面法优化工艺，利用统计分析软件Design expert11建立数学回归模型，确定六神曲总黄酮最佳提取工艺，实验设计因素水平详见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平编码

根据 Box-Behnken 的组合设计原理，采用 Design-Expert 11.0 软件设计 3 因素 3 水平共17个实验；以总黄酮提取率为响应值，具体实验设计方案与结果详见表2。

表2 实验分析方案及结果

对表2实验结果进行回归方差分析，得到六神曲中总黄酮提取率(Y)对提取时间(A)、液料比(B)、溶剂浓度(C)的三元二次多项拟合回归方程：总黄酮提取率=0.050+0.005375A-0.002B-0.007625C-0.01AB-0.00125AC-0.0055BC-0.001925A2-0.003175B2-0.009425C2

表3 回归模型方差分析

注：P<0.05表示差异有显著性，P<0.01表示差异有非常显著性，P>0.05表示差异无显著性。

2.8 响应曲面图分析 通过对响应曲面陡峭程度的分析，可以看出各因素随取值变化对响应值的影响。由图4可知，在溶剂浓度一定的情况下，提取时间与药材重量之间形成的曲面陡峭，说明2个因素的交互作用显著，当药材重量在12～14 g，提取时间在25～40 min范围时有较高的总黄酮提取效率。并且从曲面的陡峭程度可以看出，溶剂时间对提取效率的影响大于药材重量。

图4 提取时间和药材重量对六神曲总黄酮提取效率的响应面图

在药材重量一定的情况下，溶剂浓度与提取时间之间形成的曲面较陡峭，说明2个因素的交互作用较显著，当溶剂浓度在77%～83%，提取时间在25～35 min范围时有较高的总黄酮提取效率，并且从曲面的陡峭程度可以看出，溶剂浓度对提取效率的影响大于提取时间。见图5。

图5 提取时间和溶剂浓度对六神曲总黄酮提取效率的响应面图

在提取时间一定的情况下，溶剂浓度与药材重量之间形成的曲面较陡峭，说明2个因素的交互作用较显著，当溶剂浓度在77%～83%，药材重量在11～14 g范围时有较高的总黄酮提取效率。见图6。

图6 药材重量和溶剂浓度对六神曲总黄酮提取效率的响应面图

通过观察3个交互因素形成的曲面陡峭程度，提取时间与药材重量的交互影响最大，其次是溶剂浓度与药材重量和溶剂浓度与提取时间二者的交互影响。影响六神曲总黄酮提取效率因素的主次顺序为溶剂浓度>提取时间>药材重量。以上分析与表3中方差分析结果吻合。

综上，响应面法优化得六神曲中总黄酮超声辅助提取工艺的最适条件为：超声时间27.6 min、乙醇浓度 77.4%、料液比为13.3 g，在此条件下模型预测值为0.049%。

2.9 验证试验 为验证利用 Design-Expert 11.0软件优化所得结果的可靠性，对六神曲中总黄酮超声辅助提取工艺条件进行验证。选择最佳提取工艺条件：超声时间28 min、乙醇浓度 77%、药材重量13 g。测得六神曲中总黄酮的提取率为0.046%，与模型预测值0.049%相近，说明方程拟合良好，响应面优化所得的六神曲提取工艺稳定、可行。

3 讨论

六神曲作为一种传统的曲剂类中药，原料广泛，制备工艺较为简单，但缺乏统一的质量标准评价，无法保证成品质量，导致市场上六神曲质量良莠不齐。近年来，响应面法和超声波辅助法相结合用于优化提取工艺，具有简单、快速、方便的优点，故得以广泛应用。[14-15]此次研究在3个单因素的设计基础上，通过响应面优化方法得到六神曲总黄酮超声辅助提取法的最佳提取条件：药材重量为 13 g(溶剂30 mL)，提取时间为28 min，溶剂浓度为77%。在此条件下六神曲总黄酮的提取率为0.046%，与模型预测值0.049%高度相符。故该方法能为六神曲中总黄酮的研究提供依据，同时为六神曲的工业化生产提供参考。