柴胡总多糖对内毒素血症大鼠肺损伤的影响*

河北中医学院中西医结合学院

张 冬 张 豪△ 贲 莹 杜澍金 方 倩 贺 明 张凤华(石家庄 050200)

提要 目的：研究柴胡总多糖对脂多糖(LPS)诱导的内毒素血症(ETM)大鼠肺损伤的影响。 方法：选取健康雄性清洁级SD大鼠40只，遵照随机数字表法，每组8只，共分为5组：对照组(生理盐水)、模型组(LPS)、地塞米松组(阳性药组)、柴胡总多糖低剂量组(LPS+柴胡总多糖低剂量)、柴胡总多糖高剂量组(LPS+柴胡总多糖高剂量)。尾静脉注射LPS ( 4 mg/kg) 建立内毒素血症大鼠模型，1 h后分别灌胃给予柴胡总多糖(50 mg/kg、150 mg/kg)，地塞米松(2 mg/kg)。测定对照组和模型组血液细菌内毒素含量。 酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定肺组织匀浆炎症因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)]的水平。光镜和透射电镜下观察肺组织病理学变化。结果：模型组的血液细菌内毒素含量(EU/mL)明显高于对照组。与模型组相比，柴胡总多糖高剂量组可明显降低肺组织TNF-α、IL-1β和IL-6水平，减轻肺组织结构损伤。结论：柴胡总多糖通过抑制炎症反应，减轻LPS诱导的ETM大鼠肺损伤。

内毒素血症(ETM)时可引起多种促炎细胞因子的过度表达，导致全身炎症性炎症反应综合征(SIRS)和(或)多器官功能障碍综合征；其中急性肺损伤(ALI)是感染后出现最早及发生率最高的并发症之一，临床病死率高达30%～60%。[1]近年来，随着对中医学的重视及对内毒素血症的研究深入，中药制剂显示了很好的抗内毒素作用。[2-3]柴胡总多糖具有抗辐射、降血脂、增强免疫功能和抗病毒等作用，对系统性红斑狼疮、肾炎、类风湿关节炎等自身免疫性疾病具有重要的临床价值。[4]已有研究证实柴胡总多糖可通过降低内毒素诱导的肺泡灌洗液细胞脂质过氧化程度，减少ALI中肺组织补体活化产物的沉积，从而减轻肺组织损伤；可通过抑制补体和单核巨噬系统的过度激活对大鼠急性肺损伤起到保护作用。[5-6]本研究旨在通过静脉注射脂多糖(LPS)复制大鼠ETM模型，从整体水平观察柴胡总多糖对LPS诱导的大鼠肺损伤的影响。

1 材料

1.1 动物 雄性健康清洁级Sprague Dawley (SD)大鼠40只，体质量(180±20)g，河北省实验动物中心提供，许可证号1707190。实验前12 h禁食不禁水。

1.2 药品与试剂 柴胡总多糖(西安汇林生物科技有限公司，含量30.34%，批号HL-160120)；地塞米松片(0.75 mg/片，天津药业集团遂成药业股份有限公司)；LPS(美国Sigma公司，E.coli LPS, serotype 0111:B4)；内毒素显色基质鲎试剂定量检测试剂盒(厦门鲎试剂有限公司)； 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(TNF-α、IL-1β、IL-6，澳大利亚Bender MedSystem公司)；其余试剂为分析纯。

1.3 仪器 Versamax型酶联免疫检测仪(美国Molecular Devices)；高速电动匀浆器DY89-2(宁波新芝有限公司)；RM2135 Leica石蜡切片机(德国Leica公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)；尼康全自动显微照相系统(日本尼康公司)；H-7500透射电子显微镜(日本日立公司)。

2 方法

2.1 制备动物模型及分组 健康雄性清洁级，体质量(180±20)g，SD大鼠共计40只，采取1周的适应性饲养后，遵照随机数字表法，每组8只，共分为5组：对照组(生理盐水)、模型组(LPS)、地塞米松组(阳性药物组)、柴胡总多糖低剂量组(LPS+柴胡总多糖低剂量)、柴胡总多糖高剂量组(LPS+柴胡总多糖高剂量)。腹腔注射20%乌拉坦(0.5 mL/100 g)，尾静脉注入LPS ( 4 mg/kg)复制ETM大鼠模型。在LPS入血1 h后，柴胡总多糖低、高剂量组(50 mg/kg、150 mg/kg)，地塞米松组(2 mg/kg)分别灌胃给药，每天1次，连续3 d。对照组等时间点给予等量生理盐水。末次给药6 h后留取肺脏进行指标检测。

2.2 血液细菌内毒素含量 尾静脉注入LPS 1 h后，终点显色基质鲎试剂法检测对照组和模型组大鼠血液，内毒素含量>0.2 EU/mL标志成功建立ETM大鼠模型。

2.3 肺组织促炎细胞因子水平 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠右肺组织中下叶匀浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的水平。

2.4 肺组织病理学变化 取左肺上叶，10%甲醛中固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光学显微镜下观察肺组织形态学变化。取1 mm3左肺下叶组织3～5块，4%戊二醛固定，1%锇酸后固定，常规电镜标本制样，透射电镜观察肺组织结构变化。

3 结果

3.1 血液内毒素含量 模型组大鼠血液细菌内毒素含量显著高于对照组(P<0.05)，详见表1。

组别内毒素/(EU·mL-1)对照组0.13±0.03 模型组1.98±0.15△

注：与对照组比较，△P<0.05。

3.2 柴胡总多糖对肺组织促炎细胞因子水平的影响 模型组大鼠肺组织TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著高于对照组(P<0.05)。与模型组相比，地塞米松组和柴胡总多糖高剂量组可明显降低3种细胞因子水平(P<0.05)。详见表2。

组别TNF-αIL-1βIL-6对照组 509.00±121.84 412.30±54.42 104.36±18.47 模型组1 350.87±284.37△3 488.94±401.08△1 315.64±174.85△地塞米松组 881.42±164.22∗2 213.56±278.52∗ 769.37±127.60∗柴胡总多糖低剂量组1 233.11±180.28△3 183.31±505.82△1 199.25±165.08△柴胡总多糖高剂量组 981.45±127.31∗ 2 624.05±328.33∗ 813.72±161.09∗

注：与对照组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

3.3 光镜下柴胡总多糖对ETM大鼠肺组织病理学改变 对照组大鼠肺组织结构形态正常，无异常改变。模型组大鼠肺泡壁增宽加厚，毛细血管扩张淤血，伴炎性细胞浸润，肺泡腔明显萎缩塌陷。与模型组相比，地塞米松组和柴胡总多糖高剂量组可明显改善上述病变。见图1。

注：A 对照组；B 模型组；C 地塞米松组；D 柴胡总多糖低剂量组；E 柴胡总多糖高剂量组。

3.4 电镜下柴胡总多糖对ETM大鼠肺组织病理学改变 对照组大鼠肺组织结构形态正常，无异常改变。模型组大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞微绒毛减少，板层小体减少，线粒体肿胀。与模型组相比，地塞米松组和柴胡总多糖高剂量组可明显改善上述病变。见图2。

注：A 对照组；B 模型组；C 地塞米松组；D 柴胡总多糖低剂量组；E 柴胡总多糖高剂量组。

图2 电镜下观察柴胡总多糖对ETM大鼠肺组织病理学改变(×10 000)

4 讨论

内毒素，主要存在于革兰氏阴性细菌细胞壁，其主要的活性成分是脂多糖(LPS)。近年来实验室运用血浆内毒素检测，尤其是革兰阴性菌感染，具有高度敏感性且检测时间短的特点，鉴于此特点，血浆内毒素检测不仅能够及时为临床医生提供早期的疾病诊断，还可为临床医生如何针对敏感菌而应用正确合理的抗感染药物治疗进行有效的指导。[7]内毒素检测已成为临床判断ETM形成的标志。[8]临床中目前内毒素检测的方法主要应用鲎试验动态浊度法或者游离显色基质法测定，且由于此2种检测方法的前处理方式及测定原理的差异，因此ETM时判定内毒素水平的参考值亦存在一定的差异，既往研究报道显示正常大鼠血浆中内毒素水平大约在0.1 EU/mL，而ETM大鼠血浆内毒素水平>0.1 EU/mL。[9]综合文献及预实验结果，拟定内毒素水平>0.2 EU/mL为大鼠ETM。实验结果显示，模型组血液细菌内毒素含量(1.98±0.15)EU/mL，提示成功建立ETM模型。

TNF-α和IL-1β是主要的快速反应促炎介质，ALI早期短时间内即可出现，二者共同启动并产生炎症级联反应，导致全身炎症反应综合征(SIRS)的发生，在炎症过程中起着关键作用，并在一定程度上可反映病情的变化。同样作为主要的促炎细胞因子之一的IL-6， 是在TNF-α、IL-1β诱导下而生成，当肌体发生炎症反应时，可作为重要的诱生剂而诱导肝脏合成多种急性期反应蛋白，因此IL-6与肌体SIRS的发生呈正相关，也被作为是反映临床危重病患者如脓毒症、SIRS及多脏器功能衰竭等病情变化，及判断危重病患者预后的一个重要参考指标。[10]此外异常表达的TNF-α 与肺组织TNF-α 受体结合，同时释放大量酶类，直接损伤肺血管内皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞，引起肺脏炎症反应。[11]

中医学认为“热由毒生，变由毒起”，中医的热毒和内毒素在致病机制上也基本一致。可由热毒内盛、气阴两虚，使血中津液匮乏，而瘀血阻滞，因此祖国医学防治ETM，是将清热解毒、活血化瘀以及益气养阴作为根本疗法。[12]柴胡是伞形科多年生草本植物，以干燥根供药用，其性微寒，其味微辛微苦，可轻清、升发、疏散，具和解退热、疏肝解郁、升阳举陷之功。因此目前临床中常用其疏少阳之机，祛半表半里之邪，治疗发热恶寒、气虚下陷等症。[5]现代药理学研究证实，柴胡总多糖除具有抗辐射、降血脂效用外，还具有增强免疫和抗病毒的功能，对临床中常见的自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、肾炎、类风湿关节炎等具有重要的临床价值。[4]

根据实验结果，LPS诱导的模型组大鼠中，肺组织匀浆促炎细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6水平显著升高，柴胡总多糖高剂量组可明显抑制LPS诱导的肺组织炎症因子 TNF-α、IL-1β和IL-6的生成，且与地塞米松组无差异，提示柴胡总多糖可对内毒素血症大鼠肺组织损伤发挥抗炎作用。此外，LPS尾静脉注射后，光镜下模型组大鼠肺泡壁增宽加厚，毛细血管扩张淤血，伴炎性细胞浸润，肺泡腔明显萎缩塌陷。电镜下模型组大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞微绒毛减少，板层小体减少，线粒体肿胀。上述结果组织病理学改变与文献报道一致，再一次提示ETM大鼠肺损伤模型成功。应用柴胡总多糖(高剂量)后，亦可明显减轻上述肺组织病理学改变，提示柴胡总多糖可对内毒素血症大鼠的肺组织损伤有改善作用。

综合上述实验结果，柴胡总多糖可通过抑制内毒素血症大鼠急性肺损伤的炎症反应，减轻LPS诱导的肺组织损伤，对内毒素血症大鼠肺组织损伤具有一定的防治作用。