山楂中黄酮类物质的水提取工艺及理化性质研究

郭艳华，李 娇，黄 刚，吴旺喜，白建勋，张彩红，熊加严

（江汉大学 化学与环境工程学院，湖北 武汉 430056）

山楂（CrataegusL.）又称山里红、红果、胭脂果，是一种蔷薇科植物，属于药食同源的传统中药材，具有很高的营养价值和药用价值［1-5］。山楂具有活血化瘀、消食化积的作用，能降血脂和防治心血管疾病，同时，山楂中所含的黄酮类化合物具有抗衰老的作用，能增强机体的免疫力，有防癌的作用［6-9］。对天然产物中黄酮类化合物及山楂中活性成分的提取已有一些文献报道［10-17］，但是用水作为溶剂系统研究山楂中黄酮的提取工艺条件及理化性质未见报道。用蒸馏水提取山楂中黄酮成分，其浸出率高，能较为彻底地将黄酮提取出来，且具有食用安全性高、易回收等优点。笔者探讨了山楂中黄酮成分的水溶剂提取条件及提取液理化性质，为降低山楂黄酮的提取成本提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂：购于德仁堂大药房（将购买的山楂烘干除去水分，磨碎过60 目筛，放置备用）；芦丁（AR）：国药集团化学试剂有限公司；硫酸锌（AR）；氯化钙（AR）；氯化镁（AR）；氯化钾（AR）；硝酸锰（AR）；氯化钴（AR）；氯化铝（AR）；氯化钠（AR）；硫酸铁（AR）；硫酸（AR）；氢氧化钠（AR）；维生素C（AR）；蔗糖（AR）；枸橼酸（AR）；水杨酸（AR）；过氧化氢（AR）。

1.2 仪器与设备

UV—2401 紫外- 可见分光光度计：日本岛津公司；721 分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；85- 1 恒温水浴锅：国华电器有限公司；HH- 2 数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；ST-02A 多功能粉碎机：永鑫市帅通工具有限公司；RE- S2 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制 准确称取芦丁20 mg，用30% 乙醇溶解并定容至100 mL，得浓度为0.249 mg/mL 的芦丁标准溶液，再按绘制芦丁标准曲线的方法［11-13］测定吸光度，以吸光度为横坐标，芦丁标准溶液浓度为纵坐标，绘制标准曲线，得到芦丁标准曲线的回归方程为y=11.854 2x+ 0.008 68，R2= 0.999 0。

1.3.2 样品中黄酮含量的测定方法 取山楂各提取液代替芦丁标准溶液，按1.3.1 同样的方法在510 nm 处测定吸光度，根据标准曲线计算山楂各提取液中黄酮含量。

1.3.3 山楂黄酮水提取工艺条件的探讨 本课题首先从浸提剂的选择进行了探讨：在其他条件相同时，研究了蒸馏水、甲醇、70% 甲醇、无水乙醇、70% 的乙醇、醋酸、丙酮、乙酸乙酯等不同溶剂对提取山楂中黄酮含量的影响。研究结果发现：在相同的实验条件下，8 组溶剂中提取的黄酮含量依次为：70% 乙醇≈蒸馏水＞70% 甲醇＞乙醇＞甲醇＞丙酮＞醋酸＞乙酸乙酯，70% 乙醇和蒸馏水两种溶剂的提取效果相近，70% 乙醇略大于蒸馏水。从提取成本和实际生产角度出发，选择蒸馏水提取更有优势。

天然产物黄酮提取工艺条件一般还需要时间、温度、料液比及酸度的适宜条件，需要对每一种影响因素设计不同条件进行探讨；本研究对每一种影响因素设计4 ～5 种不同的条件，分别探讨浸提时间的影响、浸提温度的影响、料液比的影响、pH 值的影响，通过实验结果得到每一种影响因素下的适宜条件，从而确定水提取山楂中黄酮的适宜工艺条件。

首先探讨浸提时间对提取山楂中黄酮含量的影响，经重复性实验得到适宜时间为2 h，以下条件的探讨，均在2 h 下进行。

（1）浸提温度的影响

称取1.00 g 山楂粉末，分别在不同温度（20、30、40、50、60 ℃）下浸提，测定黄酮含量，探讨浸提温度对提取山楂中黄酮含量的影响。

（2）料液比的影响

称取1.00 g 山楂粉末，分别加入不同体积的提取剂蒸馏水（设计料液比为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50），在40 ℃的水浴中浸提2 h 后，测定黄酮含量，探讨料液比对提取山楂中黄酮含量的影响。

（3）浸提液pH 值的影响

称取1.00 g 山楂粉末，分别加入提取剂蒸馏水30 mL，浸提2 h 后，测定黄酮含量，探讨浸提液pH 值（设计pH 值为2、4、6、8、10）对提取山楂中黄酮含量的影响。

1.3.4 提取物中黄酮类物质的初步鉴定 （1）显色反应

将山楂膏状提取物用甲醇溶解，取少量分别放入6 支比色管中进行显色反应。具体操作为：①分别放在紫外光和自然光下观察，记为CK；②滴加几滴5 mol/L 氨水，分别放在自然光和紫外光下观察；③滴加1%AlCl3溶液，分别放在自然光和紫外光下观察；④滴加Na2CO3溶液于紫外光下观察；⑤滴加浓H2SO4，于紫外光下观察现象；⑥加少许Mg 和2 滴浓HCl，于紫外光下观察。

（2）紫外- 可见光谱的测定

紫外- 可见光谱法通常用于鉴定黄酮的类型或结构，不同类型黄酮的峰型、峰位和强度有所不同，可以用于判断黄酮类型，将蒸馏水提取液进行紫外- 可见光谱的测定。

1.3.5 山楂提取液理化性质的探究 （1）抗氧化活性的测定

检测·OH 常用的方法参考文献［6，20］中的Fenton 体系。Fenton 体系的反应如下：H2O2+Fe2+= ·OH+ OH-+ Fe3+。·OH 具有很高的反应活性，能被水杨酸捕捉生成有色物质，若有抗氧化剂或自由基清除剂存在，会与水杨酸竞争，使有色物质生成量减少，通过测定吸光度即可检测。在试管中依次加入3 mmol/L 的FeSO4溶液1 mL、3 mmol/L 的水杨酸溶液1 mL、待测样品溶液1 mL、3 mmol/L 的H2O2溶液1 mL，摇匀，37 ℃水浴30 min，冷却静置后，在510 nm 处测吸光度。数据计算公式为

式中，A0为空白管吸光度，以1 mL 蒸馏水代替样品溶液；Ai为样品溶液管吸光度；Aj为对照管吸光度，以1 mL 蒸馏水代替水杨酸溶液。

（2）常见食品添加剂与山楂黄酮作用的测定

先将山楂提取物进行黄酮含量的测定和抗氧化活性的测定。再取等量山楂提取物溶液，分别加入等量相同浓度的不同食品添加剂溶液，间隔一定时间观察现象，放置一段时间后，进行黄酮含量的测定和抗氧化活性的测定。

（3）常见金属离子与山楂黄酮作用的测定

配制0.10 mol/L 的硫酸锌、氯化钙、氯化镁、氯化钾、硝酸锰、氯化钴、氯化铝、氯化钠、硫酸铁的溶液，各取10 mL 的山楂溶液，加入1 mL 的金属离子溶液，在pH= 7 的条件下静置不同时间后，观察现象，放置1 h 后进行黄酮含量的测定和抗氧化活性的测定。

2 结果与分析

2.1 提取条件的确定

2.1.1 浸提温度的影响 按1.3.3 中（1）的方法测定浸提温度对提取山楂黄酮的影响，结果见图1。

由图1 可知，用蒸馏水提取山楂中黄酮时，若温度太低，提取的速度较慢，含量也较低；但温度超过50 ℃时，黄酮稳定性降低，含量减少，故适宜温度选择为50 ℃。

图1 浸提温度对黄酮含量的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on content of flavonoids extracted with distilled water

2.1.2 料液比的影响 按1.3.3 中（2）的方法测定料液比对提取山楂黄酮的影响，结果见图2。

图2 料液比对黄酮含量的影响Fig.2 Effect of extraction solid-liquid ratio on content of flavonoids extracted with distilled water

由图2 可知，蒸馏水为提取剂提取山楂中的黄酮时，适宜料液比为1∶30。

2.1.3 浸提酸度的影响 按1.3.3 中（3）的方法测定pH 值对提取山楂黄酮的影响，结果见图3。

图3 浸提酸度对黄酮含量的影响Fig.3 Effect of extraction acidity on content of flavonoids extracted with distilled water

由图3 可知，蒸馏水作提取剂提取山楂中的黄酮适宜酸度为pH = 8。

2.2 提取物中黄酮类物质的初步鉴定

2.2.1 显色反应结果 将蒸馏水溶剂提取液和乙醇溶剂提取液用旋转蒸发仪蒸发浓缩成膏状，然后用甲醇溶解，根据1.3.4 中（1）的操作方法，加入各种显色剂的显色反应实验结果见表1。由显色反应实验结果可知，提取液显色反应现象与黄酮化合物和黄酮醇相似，与文献［18- 19］报道一致。黄酮醇和黄酮化合物可经盐酸镁粉还原生成花色素而显色。能与铝盐反应生成有颜色的配合物，是因为黄酮醇和黄酮化合物分子中有邻二酚羟基，能与酸和碱反应，与分子内酚羟基及γ- 吡喃酮环有关。

表1 显色反应结果Tab.1 Results of color reaction

2.2.2 紫外- 可见光谱的测定结果 按1.3.4 中（2）的操作方法，测定了山楂提取物的紫外- 可见光谱，结果见图4。

图4 蒸馏水的山楂提取液的吸收光谱Fig.4 Absorption spectra of extraction solution of hawthorn extracted with distilled water

由图4 可见：蒸馏水提取液的紫外- 可见吸收峰出现在222.50、330.00 nm 处，这进一步说明山楂提取液的主要成分为简单黄酮类和黄酮醇类。

2.3 山楂黄酮的理化性质

2.3.1 食品添加剂与山楂黄酮的作用 按1.3.5 中（1）和（2）的操作步骤得到的实验结果见图5和图6。

由图5 和图6 可知：常见食品添加剂对山楂黄酮含量有一定影响，蒸馏水为溶剂提取的山楂黄酮含量为248.12 mg，当加入枸橼酸后黄酮含量降低到20.69 mg，说明食品添加剂与山楂黄酮有一定的化学作用。常见的食品添加剂对山楂黄酮抗氧化活性也有一定的影响，其中枸橼酸影响较小，蔗糖和维生素C 影响较大。

图5 食品添加剂对山楂提取液黄酮含量的影响Fig.5 Effect of food additives on content of flavonoids from hawthorn extraction solution

图6 食品添加剂对山楂提取液黄酮抗氧化活性的影响Fig.6 Effect of food additives on antioxidant activity of hawthorn extraction solution

2.3.2 常见金属离子与山楂黄酮的作用 按1.3.5 中（1）和（3）的实验步骤，得到常见金属离子对山楂提取液黄酮含量的影响，结果见图7 和图8。

图7 金属离子对山楂提取液黄酮含量的影响Fig.7 Effect of metal-ion on content of flavonoids from hawthorn extraction solution

图8 金属离子对山楂提取液黄酮抗氧化活性的影响Fig.8 Effect of metal-ion on antioxidant activity of hawthorn extraction solution

由图7 和图8 可知：所加金属离子对蒸馏水作为溶剂提取的山楂黄酮含量有一定影响，蒸馏水为溶剂提取的山楂黄酮含量为248.12 mg，当加入Co3+离子后影响最大，降低到13.28 mg，这可能是因为Co3+的电子结构为3d6，与山楂黄酮中的配位原子结合为金属配合物时，稳定化能最大，使得Co3+与山楂黄酮作用力最强，所以黄酮含量降低最多。所加金属离子对山楂黄酮抗氧化活性也有一定的影响［20］，抗氧化活性均有一定的降低，其中加入Mg2+和K+离子影响相对较小。

3 结语

本研究结果表明：用廉价溶剂水提取山楂中黄酮的效果良好，提取工艺条件为：提取时间2 h，温度50 ℃，山楂与蒸馏水的料液比为1∶30，酸度pH= 8，提取的山楂黄酮含量为248.12 mg，黄酮得率4.96% ，说明用水提取山楂黄酮的效果较好。初步鉴定山楂黄酮为黄酮醇类和简单黄酮类。常见食品添加剂对山楂黄酮含量及抗氧化活性有一定影响；所加金属离子对山楂黄酮含量有一定影响，Co3+离子影响最大，所加金属离子对山楂黄酮抗氧化活性也有一定的影响，其中加入Mg2+和K+离子影响相对较小。