多脂大戟中Lathyrane-type类二萜化合物对烟草花叶病毒的抑制活性分析

李博文，赵宁东，赵立华，何思洁1, ，张丽珍，李顺林，张 洁，郑 雪，龙 琴，张仲凯*，李 靖

(1．西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650224； 2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所, 云南省农业生物技术重点实验室, 农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室， 云南 昆明 650223； 3.文山学院化学与工程学院，云南 文山 663000；4.中国科学院昆明植物研究所，云南 昆明 650201)

【研究意义】烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)隶属于披盖病毒科烟草花叶病毒属，是发现最早、危害最广的植物病毒，可侵染包括单子叶植物和双子叶植物在内的800多种植物[1-2]。TMV 严重危害烟草、辣椒等多种经济作物，甚至造成烟草区域内的毁种、绝收，给农业生产造成了巨大的经济损失，被列世界十大病毒首位[3-4]。然而，目前尚没有理想的抗TMV途径。研究表明，生物源农药的研发是防治该病害的重要途径之一。因此从植物中寻找抗 TMV 活性物质具有重要意义。【前人研究进展】多脂大戟(Euphorbiaresinifera) 为大戟属植物，原产欧洲，非洲亦产，英国、前苏联等也有分布，为多年生灌木状草本，主要含有萜类、黄酮类、鞣质类等化学成分[5-6]。前人研究显示因其活性成分具有抗肿瘤、抑菌消炎、驱寒止痛、促消化等功效，临床常用于治疗湿寒性或黏液质性疾病，如风湿、癌症、瘫痪、抽搐、腹水等疾病[7]，但其主要活性成分大戟脂具有毒性，临床上应紧慎使用[8]。截止目前未发现其活性成分抗TMV的研究报道。对于TMV的防治，使用从植物中提取的活性物质为有效成分的植物源抗病毒剂是主要的防治方法。有研究发现靛红的丙酮缩合物3-丙酮基-3-羟基羟吲哚 (3-Acetonyl-3-hydroxyoxindole, AHO) 通过激活特异的miRNAs和PR10基因的表达诱导烟草的SAR抵御TSWV侵染[9]。赵立华等发现肿柄菊中提取的倍半萜类化合物Tagitinin C和1β-methoxydiversifolin-3-0-methyl ether能通过抑制TMV CP基因和RdRp基因的复制阻止TMV侵染[10]。近年来不断从植物中提取到新的抗TMV化合物，例如黄酮、二萜类化合物、生物碱、吡唑等都具有良好的抗TMV活性[11-15]。目前市售的能有效抑制 TMV 侵染的生物源农药以植物中提取的安托芬和毒氟磷为主[16-17]。【本研究切入点】TMV防治一般采用选育抗病品种、物理防治、化学药剂防治等方法。化学药剂防治效果好，但在田间对作物会产生一定的毒害，也不易降解；而从植物中提取的活性物质为有效成分的植物源抗病毒剂具有环境兼容性好、安全、开发成本低等优点，因此近年来植物源抗病毒剂的研究日益受到人们重视。为此，本实验从多脂大戟中分离的 11 种抗病毒先导化合物进行烟草抗TMV活性试验，以宁南霉素作为对照，应用预防试验和防控试验2 种筛选方法，旨在为TMV的有效防控奠定基础。【拟解决的关键问题】本研究采用枯斑法对从多脂大戟中分离的11种化合物进行抗 TMV 活性测定。通过对化合物在防控实验和预防实验中的活性检测，以期发现多脂大戟二萜类化合物中可作为抗TMV病毒病害环保型生物源农药研发的先导化合物。

1 材料与方法

1.1 供试材料

11种化合物来自中国科学院昆明植物研究所李顺林研究员课题组，化合物名称、结构图详见表1。宁南霉素购于黑龙江德强生物股份有限公司。

寄主植物心叶烟(Nicotianaglutinosa)、K326(Nicotianatabacumcv. K326)、TMV 毒源由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所植物病毒室保存提供。

表1 化合物名称

续表1 Continued table 1

编号Number化合物名称Name of compound结构图StructureHZ-12(化合物3)Euphorblin BHZ-13A(化合物4)Euphorblin QHZ-15A(化合物5)Euphorblin IHZ-16(化合物6)Euphorblin LHZ-17(化合物7)Euphorblin HHZ-22(化合物8)Euphorblin A

续表1 Continued table 1

编号Number化合物名称Name of compound结构图StructureHZ-31(化合物9)euphorbia factor RL 4HZ-54(化合物10)sooneuphanone DHZ-55A(化合物11)epi-kansenonol

1.2 TMV 提取液的提纯制备

参考Gooding的方法[18]，选取接种 TMV 21dpi 的K326病叶进行提纯。

1.3 化合物溶剂的制备

用二甲基亚砜(DMSO)将11个化合物分别溶解成浓度为10 mg/mL的母液，再用ddH2O稀释成100 μg/mL。宁南霉素用ddH2O稀释成浓度为80 μg/mL(参照说明书)。

1.4 防控实验

防控实验设11 个处理，化合物1到化合物11分别为处理1到处理11，各处理选取长势一致、生长健壮的真叶期(5～6叶期)心叶烟叶片，人工摩擦接种 TMV，10 min后用ddH2O喷洗，24 h后再均匀涂抹化合物制剂(用量1 mL)，10 min后再用ddH2O喷洗。试验设阳性对照2个和空白对照1个，其中阳性对照(CK1)为先涂抹TMV，24 h后涂抹H2O，用于计算抑制率；阳性对照(CK2)为先摩擦接种TMV，24 h后涂抹宁南霉素；空白对照(CK3)为先涂抹H2O，24 h后涂抹DMSO。烟苗生长于无虫温室中；每组处理重复3次。2～3 dpi，接种叶片出现枯斑，调查统计枯斑数，并按下式计算抑制率：

抑制率=(C-T)/C×100 %

式中,C：阳性对照枯斑平均数，T：处理枯斑平均数。

1.5 预防实验

预防实验设 11 个处理，化合物1到化合物11分别为处理1到处理11，各处理先用不同化合物制剂涂抹真叶期(5～6叶期)心叶烟叶片，10 min后用ddH2O冲洗，6 h后摩擦接种 TMV，10 min 后再用ddH2O喷洗。试验设阳性对照2个和空白对照1个，其中阳性对照(CK1)为涂抹H2O，6 h后涂抹TMV；阳性对照(CK2)为先涂抹宁南霉素，6 h后摩擦接种TMV；空白对照(CK3)为先涂抹DMSO，6 h后涂抹清水。烟苗生长于无虫温室中。每组处理重复3次。2～3 dpi ，接种叶片出现枯斑，调查统计枯斑数，并计算抑制率。

2 结果与分析

2.1 化合物的防控作用

从图1～2可见，在防控试验(接种 TMV， 24 h 后涂抹化合物制剂)中所使用的11种化合物制剂对 TMV 表现出不同程度的防控效果，化合物5、化合物8、化合物9和化合物10对TMV的抑制率分别为47.16 %、29.98 %、30.82 %、25.69 %，有一定抑制TMV侵染的活性，但未超过对照药剂宁南霉素的抑制率52.89 %；但化合物1(HZ-7，Euphorblin E) 的抑制率为67.54 %，超过了对照药剂宁南霉素的，图1也可看出其枯斑数少于对照，表明化合物1(HZ-7，Euphorblin E)有较好的防控效果。

A：阳性对照(CK1)；B：阳性对照(CK2)；C：化合物1处理(HZ-7)A: Positive control 1(CK1); B: Positive control 2 (CK2)；C: Treatment of compound1 (HZ-7)图1 防控实验接种效果Fig.1 Effect of inoculation in curative experiment

1～11：化合物1至化合物11；CK2：阳性对照2(宁南霉素)1-11: Compound1-compound11; CK2: Positive control 2 (Ningnanmycin)图2 防控实验中不同化合物对TMV的抑制率Fig.2 Inhibition rate of TMV with different compound in curative experiment

2.2 化合物的预防作用

预防实验(涂抹化合物制剂，6 h后接种TMV)先通过涂抹化合物制剂诱导寄主的抗性，使植物处于“Priming”状态进而抵御病原菌的侵染。由图3～4可见，在预防试验中所使用的11种化合物制剂对 TMV 表现出不同程度的防控效果，化合物3、化合物4、化合物6和化合物11对TMV的抑制率分别为43.30 %、37.29 %、21.21 %、25.00 %，有一定抑制TMV侵染的活性，活性未超过对照药剂宁南霉素的抑制率58.21 %，但化合物1(HZ-7，Euphorblin E)的抑制率为72.30 %，超过对照药剂宁南霉素的，图3也可看出枯斑数少于对照，表明化合物1(HZ-7，Euphorblin E)有较好的预防效果，且预防效果优于防控效果。

3 讨 论

多脂大戟作为药材，起主要作用的是其分泌物大戟脂(Euphorbium)，大戟脂具有强烈的刺激性，具有强烈泻下，催喷嚏，抑制牙齿或神经产生的疼痛，治疗关节疼痛等作用[19]。目前对于多脂大戟化学成分的相关报道很少，也没有抗植物病毒方面的研究，故大戟脂化学成分上还有很大的研究空间，有必要对其开展系统研究，挖掘其潜在的生物活性。

A：阳性对照(CK1)；B：阳性对照(CK2)；C：化合物1处理(HZ-7)A: Positive control 1(CK1); B: Positive control 2 (CK2)；C: Treatment of compound 1 (HZ-7)图3 预防试验接种Fig.3 Effect of inoculation in control experiment

1～11：化合物1至化合物11；CK2：阳性对照2(宁南霉素)1-11: Compound1-compound11; CK2: Positive control 2 (Ningnanmycin)图4 预防实验中不同化合物处理对TMV的抑制率Fig.4 Inhibition rate of TMV with different compound treatments in protective experiment

烟草作为中国重要经济作物，一直产生着巨大的经济效益，而烟草花叶病毒是危害其产量和质量的主要病因，防治此病成为烟草产业的重中之重，目前对于TMV的防治中，高效、绿色无污染的植物源抗病毒剂较少，开发出低毒、高效、广谱的植物源抗病毒制剂迫在眉睫。本研究中发现，分离自多脂大戟的11个化合物对TMV有一定的抑制活性。其中对TMV抑制活性最高的化合物为HZ-7(Euphorblin E)，在防控作用和预防作用抑制率分别为67.54 %和72.30 %(浓度为100 μg/mL)，均显著高于对田间病毒病有明显防控效果的对照药剂宁南霉素，宁南霉素作为一种广谱杀菌剂，目前生产上应用比较广泛[20-21]。本研究中筛选的多脂大戟化合物对 TMV有一定的抑制活性，且HZ-7的抑制活性高于对照药剂宁南霉素，同时预防作用优于防控作用，可作为农业生产中生物源药剂研发的先导化合物，具有重大的学术和经济意义。

4 结 论

通过对多脂大戟中提取的11个Lathyrane-type类二萜化合物进行活性测定。结果表明，其中HZ-7(Euphorblin E)对TMV 抑制活性最高，在防控作用和预防作用中抑制率分别为67.54 %和72.30 %(浓度为100 μg/mL)，均显著高于对照药剂宁南霉素。此研究可为抗TMV生物药剂的研发提供先导化合物，并为开展绿色防控体系提供重要的材料基础。