不同栽培模式对冬作马铃薯根际土壤真菌多样性的影响

杨鑫 樊吴静 李丽淑 何虎翼 唐洲萍

摘要：[目的]从土壤微生态角度研究不同覆盖栽培模式对冬作马铃薯根际土壤真菌多样性的影响，旨在为广西冬作马铃薯生产探索最佳栽培模式。[方法]采用I lluminaMiseq高通量测序技术对马铃薯在黑地膜覆盖栽培、稻草覆盖栽培和常规栽培（对照）3种处理条件下的马铃薯全生育期根际土壤真菌群落进行多样性分析。[结果]黑地膜覆盖栽培的根际土壤真菌多样性指数最高，其中黑地膜覆盖栽培Simpson指数与稻草覆盖栽培差异达显著水平（P<0.05）;不同处理优势菌株种类和相对丰度随着马铃薯生育进程呈现不同变化规律，子囊菌门均为最优势真菌门，其中黑地膜覆盖栽培子囊菌门相对丰度最高，3种栽培模式的优势菌属分别为头束霉属、田头菇属、被孢霉属;在马铃薯生长后期，黑地膜覆盖栽培处理的根际土壤中被孢霉菌、头束霉属、粉红粘帚霉属、枝顶孢属的相对丰度比常规栽培处理的高，稻草覆盖栽培处理镰孢菌相对丰度较其他两个处理的更低。[结论]黑地膜覆盖栽培处理的根际土壤真菌群落结构和多样性比稻草覆盖栽培和常规栽培处理更加优化和丰富，有利于土壤中有机质的分解轉化和有益微生物的生长繁殖，可为马铃薯生长发育提供充足的养分条件和稳定的根际微生态环境;稻草覆盖栽培可以缓解镰孢菌引起的马铃薯土传病害。

关键词：高通量测序;根际土壤;真菌多样性;黑地膜覆盖;马铃薯

中图分类号：$532文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2020）02-0192-08

0 引言

（研究意义）真菌是土壤中一类重要的微生物，具有降解有机质、驱动养分循环、促进植物生长、参与植物病虫害生物防治等功能，是评价土壤质量的生物指标。因此，研究根际土壤真菌多样性对马铃薯土传病害防控和土壤微环境改良具有重要意义。（前人研究进展）根际土壤真菌的多样性在维持土壤生态系统平衡和土壤质量方面起到了重要的作用，根际土壤是直接受植物根系及其分泌物影响的土壤区域，是土壤微生物与植物相互作用的重要场所，植物通过根系活动影响根际土壤的养分含量和土壤理化性状，并改变根际微生物群落组成和多样性。同时，根际土壤微生物多样性和优势菌属的变化，也会在一定程度上反映出土壤肥力和质量的变化趋势。传统的土壤真菌研究方法，如平板培养法可以得到少部分的可培养真菌，但无法获得其真菌群落结构组成和功能等信息。高通量测序作为第二代测序技术，具有操作简单、成本低、结果可信度高等优势，能够一次并行地对几百万条，甚至上千万条的DNA序列分别进行测序，有助于准确分析环境中微生物的组成和分布，能够深入了解微生物群落组分在科、属和OTU（Operational/axonomicUnits，指分类研究的个体，真菌分类中一般是指菌株）水平上的变化。徐雪雪等采用I lluminaMiseq方法，对不同沟垄覆膜种植模式下马铃薯连作的根际土壤真菌多样性进行研究，认为采用全膜垄播种植处理的土壤真菌多样性最高，半膜垄播种植对镰孢菌引起的马铃薯病害有一定的防治作用。张国青等基于真菌ITSl高通量测序，证明环保肥料增效剂可明显改善土壤真菌的种群结构。姜晓芳通过高通量测序方法对全生育期马铃薯根际土壤微生物群落多样性进行研究，结果表明：稻草包芯栽培模式可不同程度改变土壤的细菌和真菌群落结构，提高土壤细菌群落多样性，降低土壤真菌多样性，在马铃薯生育关键期可通过提高土壤抑菌性真菌丰度来抑制某些病原菌的增长。（本研究切入点）目前，采用高通量测序分析技术对南方冬作区马铃薯不同覆盖栽培模式下微生物多样性的研究鲜有报道。（拟解决的关键问题）揭示不同覆盖栽培模式下冬作马铃薯根际土壤真菌物种多样性和群落结构的变化规律，探讨在不同栽培模式下马铃薯全生育期根际土壤真菌多样性的变化规律。

1 材料与方法

1.1试验地概况

试验在广西农业科学院武鸣里建科研基地内进行。该地区海拔117m，年均降水量1233.4mm，年平均气温21.9℃，无霜期360d.试验地前茬作物为玉米，土壤为砖红壤，0～20cm土层的基本理化性质：pH值5.1，含速效氮120mg·kg^-1、速效磷39mg·kg^-1、速效钾106mg·kg^-1、有机质30.4g·kg^-1。

1.2 试验设计

供试马铃薯品种为华薯l号，由华中农业大学提供，一级原种。田间试验采用单因素随机区组设计，设3个处理，分别为：处理A，黑地膜覆盖;处理B，稻草覆盖;处理C（CK），无覆盖的常规栽培，作为对照。各处理3次重复，共9个小区，小区面积24m²（每小区4行）。马铃薯采用单垄双行种植，株距25cm.于2018年11月24日种植，2019年3月成熟收获。

1.3 样品采集

分别在马铃薯苗期（12月24日）、块茎形成期（1月24日）、块茎膨大期（2月9日）、淀粉积累期（2月24日）、块茎成熟期（3月24日）采集土样。采用五点取样法在每个小区每隔4株间取样，5个点的土样混合均匀后为该小区的土样。取样时将马铃薯整株挖出，注意不伤到根系，轻轻抖落根系上较大土块，用消毒过的毛刷刷下根系表面（约2～3mm）的土作为根际土壤样品，土样封装到无菌封口袋中，用冰盒带回实验室置于-80℃冰箱保存，用于土壤微生物DNA提取及后续测定。

1.4根际土壤总DNA提取及测序

将采集的土壤样品送到北京百迈克生物科技有限公司进行IlluminaMisep 2500高通量测序。利用前向引物ITSIF（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和反向引物ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）对真菌ITSl区进行PCR扩增，PCR反应采用20uL体系。PCR扩增条件为1×（5min、95℃）;35×（1min、95℃，1min、50℃，1min、72℃）;1×（7min、72℃）;4℃保存。

1.5数据分析与处理

根据PE Reads之间的Overlap关系，将测序得到的双端序列数据拼接成一条序列Tags，同时对Reads的质量和拼接效果进行质控过滤。主要步骤：（1）使用FLASHvl2.7软件，通过Overlap对每个样品的Reads进行拼接，得到的拼接序列即原始Tags数据。（2）使用TrimmomaticV0.33软件，对拼接得到的Raw Tags进行过滤，得到高质量的Tags数据。（3）使用UCHIMEv4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据（Effective Tags）。信息分析内容：划分OTU，进行多样性及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 测序数据质量评估及OTU聚类分析

对15个样品ITS2区测序的原始数据进行PEReads拼接，Tags过滤和去嵌合体后，共得到1032153条有效序列，平均每个样品有68810条有效序列，其中：处理A平均有效序列73157条、处理B平均有效序列73453条、处理C平均有效序列73021条，每条序列平均长度249bp、有效率达91.4%，具体见表1.

图1是相似度为0.97条件下各土壤樣品的稀释曲线，利用稀释曲线可了解样本间的物种多样性和丰富程度，以及样本取样深度情况。图1的横坐标为样本中随机抽取的测序条数，纵坐标为该测序条数聚类得到的OTU数量，每条曲线代表表1的1个样品，随着测序条数的加大，曲线趋于平缓，表示此环境中的物种并不会随着测序数量的增加而显著增多，所有样本文库的测序深度指数在99.92%～99.97%。说明取样合理，环境中真菌群落结构的置信度高，能够真实反映土壤样本的真菌群落。

2.2 不同栽培模式冬作马铃薯根际土壤真菌群落多样性分析

通过多样性分析可以反映单个样品物种多样性和物种丰度，常用衡量指标有：ACE、Chaol、Shannon和Simpson，ACE和Chaol为物种丰富度指数，Shannon和Simpson为物种多样性指数。ACE和Chaol指数越大，说明物种数量越多;Shannon指数越大，Simpson指数越小，说明样品的物种多样性越高。由表2看出，各处理的根际土壤真菌丰富度指数ACE排序为：处理C>处理B>处理A，丰富度指数Chao1排序为：处理C>处理A>处理B，3个处理之间的丰富度指数Chaol差异均达显著水平;多样性指数Simpson排序为：处理B>处理C>处理A，多样性指数Shannon排序为：处理A>处理C>处理B，其中处理A与处理B的Simpson指数差异达显著水平。由此可知，处理C马铃薯根际真菌丰富度最高，处理A马铃薯根际土壤真菌多样性指数最高。

不同栽培模式处理的马铃薯全生育期根际真菌多样性变化规律不同，处理A真菌多样性指数Shannon表现为随着生育进程呈先降低后升高再降低的趋势，而处理B和处理C均表现为呈先升高后降低再升高最后又降低的趋势。处理A₃多样性指数Simpson与处理B₃差异达显著水平，说明黑地膜覆盖栽培比稻草覆盖栽培可提高马铃薯块茎膨大期根际土壤的真菌多样性;与对照处理（C₃、C₄）相比，处理A（A₃、A₄）显著提高了马铃薯块茎膨大期到淀粉积累期真菌群落的物种丰富度指数;与处理B（B₄、B₅）相比，处理A（A₄、A₅）提高了马铃薯淀粉积累期到成熟期真菌群落的物种丰富度指数，但差异不显著。

2.3 不同栽培模式冬作马铃薯根际土壤真菌群落结构多样性分析

由图2可知，在门分类水平上不同处理间真菌群落结构相似，主要有子囊菌门（Ascomycota）、被孢菌门（Mortierellomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、丝足虫类（Cercozoa），以及其他未分类真菌（Fungi-unclassified），其中：子囊菌门是优势菌门，处理A占比最高（76%），处理C占比69%，处理B占比58%;次优势菌门为被孢菌门，处理C占比最高（16%），处理A、处理B占比均为11%。担子菌门比例以处理B最高（20%），而且处理A和处理C担子菌门比例均为3%;处理B的丝足虫类相对丰度比其他处理高，属于特异菌门。

通过对马铃薯不同生育期门分类水平真菌群落结构相对丰度的分析结果可知，处理A和处理C的子囊菌门相对丰度随着马铃薯生育期推进变化不大，处理B的子囊菌门变化较明显。处理A₃子囊菌门在块茎膨大期相对丰度分别比处理B₃、处理C₃提高95%、38%，处理A真子囊菌门在淀粉积累期相对丰度比处理B，提高147%，处理A₁担子菌门在苗期相对丰度分别比处理B₁、处理C₁提高50%、89%，处理A₅担子菌门在块茎成熟期相对丰度分别比处理B₅、处理C₅提高67%、40%，处理A₄担子菌门相对丰度在淀粉积累期分别比处理B₄、处理C₄提高33%、300%。

由图3可知，不同覆盖栽培模式在属分类水平上主要有被孢霉属Mortierella、小不整球壳菌Plectosphaerella、头束霉属Cephalotrichum、假裸囊菌属Pseudogymnoascus、粉红粘帚霉属Clonosmchys、田头菇属Agrocybe，所占比例均在4%～16%范围。此外，还有镰孢菌属Fusarium、赤霉菌薯Gibberella、Mariannaea、毛壳菌属Chaetomium所占比例较低，均在1%～3%之间。通过真菌群落丰度比例可知，处理A的优势属为：头束霉属（相对丰度13%），次优势属依次为被孢霉属（相对丰度12%）、小不整球壳菌（相对丰度10%）、假裸囊菌属（相对丰度6%）、粉红粘帚霉属（相对丰度5%）、镰孢菌属（相对丰度3%）;处理B优势属为：田头菇属（相对丰度15%），其他菌属依次为小不整球壳菌（相对丰度12%）、被孢霉属（相对丰度11%）、头束霉属（相对丰度6%）、假裸囊菌属（相对丰度6%）;对照处理C优势属为：被孢霉属（相对丰度16%），次优势属依次为小不整球壳菌（相对丰度10%）、假裸囊菌属（相对丰度7%）、头束霉属（相对丰度4%）。由此可见，不同栽培模式根际土壤真菌群落优势菌株种类和丰度存在较大差异，处理A和处理B的物种多样性比处理C（对照）丰富。