基于DPPH法的茶叶儿茶素类抗氧化谱效关系研究

林清霞 王丽丽 杨军国 宋振硕 陈林

摘要：[目的]研究茶叶儿茶素HPLC指纹图谱与其自由基清除活性的关系。[方法]采用70%甲醇对绿茶、白茶、闽北乌龙、闽南乌龙、红茶5类共25批次样本进行提取;以福林酚法测定总酚含量;以1.1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法研究自由基清除活性;同时通过高效液相色谱法（HPLC）获取指纹图谱数据并对所获取的指纹图谱数据进行主成分分析;采用偏最小二乘回归分析研究HPLC指纹图谱与DPPH清除活性的谱效关系，结合皮尔逊（Pearson）相关性分析对偏最小二乘回归模型进行验证。[结果]获取25批次样本的HPLC指纹图谱，确定了8个儿茶素类化合物，成功构建了偏最小二乘回归方程，其决定系数R²=0.9009.结果表明表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）与DPPH清除力相关性最强，均呈极显著正相关;没食子酸（GA）与DPPH清除力呈负相关。Pearson相关性分析结果与偏最小二乘回归模型结果基本一致。[结论]本研究通过HPLC指纹图谱信息可预测抗氧化活性。

关键词：儿茶素;抗氧化;高效液相色谱（HPLC）;谱效关系

中图分类号：TS272文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2020）02-4210-07

0 引言

（研究意义）谱效关系是中医药研究人员提出的一种全新的思维方式，即采用高效液相色谱（High performance uquid chromatography，

HPLC）、近红外光谱（Near infrared spectrometry，NIR）、核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）、气质/液质联用（Gas chromatography/Liquid chromatography-Mass spectrometry，GC/LC-MS）等先进分析技术获得样品的化学指纹图谱，也就是“谱”：同时采用传统分析方法获得这些样品的活性数据，也就是“效”：将所得到的两组数据通过合适的化学计量学和统计学方法进行数据挖掘和处理，从而建立指纹图谱与药效之间的关系模型。通过模型即可预测药效大小，實现高通量分析，极大提高分析速度，缩短分析时间。（前人研究进展）谱效方法的提出为中药研究解决了许多难题，中药成分复杂，其药效是多种成分共同作用的结果，通过谱效关系研究可以阐明具有协同作用或拮抗作用的有效成分组成，从而揭示药效物质基础。徐晶晶等通过谱效关系研究，筛选出薄荷药材中发挥抗氧化活性的化学成分群，为合理确定中药药效物质基础起到了积极作用。中药药效基础为多成分共同作用，而每个成分对药效贡献度不一致。Zhu等通过谱效关系研究，确定了各化合物的活性贡献度的大小顺序，从而阐明了有效成分的组成、数目和对集体的作用程度。Xu等指出，谱效关系的研究能够反映中药内在质量的效果指纹，可以通过化学指纹图谱来评估中药质量。（本研究切入点）茶叶与中药类似，内含成分复杂，其抗氧化活性亦是多成分共同作用的结果，传统的茶叶抗氧化活性检测方法，如1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical 2，2-D真phenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH]、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid），ABTS]、铁离子还原航氧化力测定法（Ferricreducinz/antioxidant power assay，FRAP）等只能检测茶叶的总抗氧化能力，无法确定各成分对抗氧化活性的贡献度，只有先经过提取、分离、鉴定后再分别对各成分进行抗氧化活性测定。对单一组分的抗氧化成分进行提取、分离易导致其活性的改变，无法准确评价其抗氧化能力，且传统测定方法耗时费力。茶多酚是茶叶中最主要的抗氧化活性成分，其中儿茶素类约占茶多酚总量的60%～80%。（拟解决的关键问题）本研究采用DPPH法对茶叶的抗氧化活性与其儿茶素类HPLC指纹图谱进行谱效学分析，探讨其图谱特征峰抗氧化活性大小并建立模型，以期通过谱效模型预测茶叶儿茶素的抗氧化活性，实现茶叶抗氧化活性的快速分析。

1 材料与方法

1.1材料与设备

供试材料：从市场购得不同类别茶叶样本共计30批次，25批次作为训练集用于建模，具体构成为：5批次绿茶（Gl、G2、G3、G4、G5），5批次白茶（W1、W2、W3、W4、W5），5批次闽北乌龙（N1、N2、N3、N4、N5），5批次闽南乌龙（S1、S2、S3、S4、S5），5批次红茶（Bl、B2、B3、B4、B5），另外5批次茶样（Rl、R2、R3、R4、R5）作为测试集对回归模型进行外部检验。从训练集中随机抽取5批次（Gl、B3、N4、W3、S5）对回归模型进行内部验证。

主要试剂：没食子儿茶素（Gallocatechin，GC）、表没食子儿茶素（Epigallocatechin，EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、表儿茶素（Epicatechin，EC）、没食子儿茶素没食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）、表儿茶素没食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）、儿茶素没食子酸酯（Catechin gallate，CG），上述儿茶素标准品纯度均>98%，美国Sigma公司;没食子酸（Gallic acid，GA，分析纯），生工生物工程（上海）股份有限公司;甲醇（色谱纯），Sigma-Aldrich;甲酸溶液[含量49%-51%（T），色谱纯，Fluka;DPPH（纯度>97%），京东化成工业株式会社;无水乙醇和甲醇（分析纯），上海国药。

主要仪器设备：美国Agilent 1260型液相色谱系统，包括四元泵（G1311CVL）、标准自动进样器（G1329B）、柱温箱（G1316A）和二极管阵列检测器（G1315DVL）;CD-0502-U实验室超纯水系统，重庆艾科浦;HWs.28电热恒温水浴锅，上海恒科;VARIOSKAN LUX酶标仪，美国Thermo SCIENTIFIC公司;T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用。

1.2 试验方法

1.2.1茶叶多酚总量的测定 茶多酚（Teap01yphenols，TPs）总量：参照GB/T8313-2018，采用福林酚（Folin-Ciocalteu）法测定。

1.2.2茶叶DPPH自由基清除率测定DPPH溶液的配制：精密称取DPPH适量，加无水乙醇溶解配成0.1mmol·L^-1的DPPH溶液，现配现用。茶样提取方法采用GB/T 8313-2018，用纯水稀释100倍后即为茶样测试液，用于DPPH自由基清除试验，限当日使用。

试验发现茶样测试液添加量为180uL时，各茶样清除浓度均在其线性范围内，即取茶样测试液180uL，加纯水1.82mL，再加0.1mmol·L^-1的DPPH溶液2mL，测定比较25个茶样对DPPH自由基的清除活性。

1.2.3茶叶HPLC指纹图谱采集采用TSKgelODS-IOOZ色谱柱（4.6mm×150mm，5um，日本Tosoh公司），以0.1%甲酸水溶液（A相，v/v）和甲醇（B相）为流动相，洗脱方式为83%A（0min）-75%A（5min）-73%A（7min）-58%A（16min）-83%A（18min），柱温40℃，流速1.0mL-min，检测波长280nm.

1.3 数据处理

采用ChemPattern 2017对供试样品的HPLC化学指纹图谱进行分析;采用Origin 8.5对总酚含量和DPPH清除活性数据进行处理;采用SPSS 19.0软件对试验数据进行Pearson相关分析。

2 结果与分析

2.1 茶叶多酚总量与DPPH清除活性关系

为确保參与建模的DPPH数据有效，本研究探讨了TPs与DPPH清除活性关系，见图1.总体来看，TPs与DPPH清除活性呈正相关，Pearson相关分析显示TPs与DPPH清除率相关系数为0.874，这与文献报道DPPH清除能力与TPs之间呈显著正相关的结果一致。绿茶、白茶的TPs在各类茶中含量最高，乌龙茶次之，红茶最低，DPPH清除能力大小变化趋势与TPs一致，与文献报道相同。这可能是由于绿茶属不发酵茶，白茶发酵程度较低，TPs含量高，均很大程度保留了鲜叶中的功效成分;乌龙茶属半发酵茶，红茶属全发酵茶，发酵程度越高，TPs氧化程度越高。这一结果验证了DPPH清除活性数据的有效性。

2.2 儿茶素类HPLC指纹图谱与DPPH清除活性关系

2.2.1HPLC指纹图谱的主成分分析 HPLC指纹图谱数据是参与建模的另一组数据，采用Chempattem2017软件对25个样品的HPLC指纹图谱数据进行主成分分析。从图2可以看出第l主成分（PCI）和第2主成分（PC2）分别解释了各色谱峰总变异的66.28%和29.66%，累计方差总变异贡献度达95.94%。各茶类存在明显的类群区分，绿茶、白茶、乌龙茶、红茶从左向右偏移，这可能是因为各类茶制作工艺不同，其活性化学成分和含量也不同。绿茶属不发酵茶、白茶属轻发酵茶，二者相距较近;乌龙茶属半发酵茶，居中;红茶属全发酵茶，右移最多;即发酵程度越重，右移越多。本研究所选用的样品为绿茶、白茶、闽北乌龙、闽南乌龙、红茶5类茶样，这5类茶样的HPLC指纹图谱数据的主成分分析亦成功划分为5个类群，并按发酵程度有序偏移，这在一定程度验证了HPLC指纹图谱数据的有效性。

2.2.2基于偏最小二乘法的儿茶素类抗氧化谱效关系采用Chempattern 2017对HPLC指纹图谱数据进行处理。图3为25个样品的HPLC指纹图谱叠加图。以GA、GC、EGC、EGCG、EC、GCG、ECG、CG作为研究对象，以其峰面积参与构建模型，各化合物峰面积数据见表1.分析前对8个化合物的峰面积数据进行Auto-scaling预处理，处理后的量纲数据与DPPH清除率建立偏最小二乘回归。以峰面积为自变量（X），抗氧化活性数据为因变量（Y），建立偏最小二乘回归方程，Y=48.4264-1.0387X_GA+0.8351X_GC+3-2989X[_EGC2.5719X_EGCG-1.0467X_EC+1.2953X_GCG+1.9433X_ECG+0.1999X_CG，决定系数R²=0.9009，潜变量数保留3个（潜变量数的选择会影响模型X的解释率以及模型Y的预测率，当潜变量数保留3个，模型对X的解释率以及Y的预测率最优），模型X累积解释率R²X达87.85%，模型Y预测率Q2²Y达86.32%。方程回归系数的符号确定色谱峰与活性指标的相关变化方向（即正、负相关），回归系数的大小确定色谱峰对活性指标的重要程度。由此可知，EGC、EGCG、ECG与DPPH清除力相关性最强，均呈正相关;GA与DPPH清除力呈负相关。对回归方程进行假设检验（假设H₀=数据间不存在显著线性回归关系），其结果见表2.按显著性水平α=0.05，数据间存在显著线性回归关系。内部检验以及外部验证结果见表3，内部检验的相对标准偏差均小于5.62%，外部验证的相对标准偏差均小于10.97%。由此可以看出，利用HPLC指纹图谱和抗氧化数据构建茶样的谱效关系具有一定的实用价值。

多种统计方法并用能够更加详尽解释谱效关系，亦可达到相互佐证效果。本研究采用SPSS19.0软件对8个化合物的峰面积与其对应的DPPH清除率数据进行双变量相关性分析，显著性检验采用双侧检验（T），相关系数选择Pearson.8个化合物与DPPH清除力的相关性如表4所示，对清除自由基贡献度排名前三的化合物为EGCG、EGC、ECG，三者与其DPPH清除力均呈极显著正相关，GA与DPPH清除力呈极显著负相关，这与偏最小二乘回归方程结果基本一致。

3 讨论

合理的数据处理是谱效关系研究的核心。茶叶内含成分复杂，各成分存在多重相关性，偏最小二乘回归分析法集主成分分析、多元线性回归分析、典型相关分析于一体，能够在自变量存在多重相关情况下进行回归建模，适用于本研究。建立谱效关系所采用的各种化学计量学和统计学方法都存在一定的局限性，这要求我们多种统计方法并用，能够更加准确地解释谱效关系。偏最小二乘回归分析法是基于观测数据建立变量之间某种依赖关系，寻找内在规律并用于预测控制的一种统计方法，能够反应各个色谱峰对应成分对活性指标的综合作用效果。Pearson相关分析可研究连续变量之间的相关性，反映2个或多个变量之间相关程度与方向，可通过相关系数评价其相关性，能独立算出每一个色谱峰对活性的影响。因此，本研究选用偏最小二乘回归分析对25个茶叶的指纹图谱以及茶叶的DPPH清除活性這两组数据进行解析，并引入Pearson相关分析对偏最小二乘回归模型进行验证。

茶多酚是茶叶的主要活性成分，是茶叶品质及生物学活性评价的主要指标，茶叶抗氧化活性与茶多酚含量密切相关。儿茶素类化合物为茶多酚的主体成分，约占茶多酚总量的60%～80%，因此茶叶的抗氧化活性可用儿茶素进行评价。本研究以GA、GC、EGC、EGCG、EC、GCG、ECG、CG为试验对象，以其峰面积为自变量（X），抗氧化活性数据为因变量（Y），成功构建偏最小二乘回归方程为卜48.4264-1.0387X_GA+0.8351ZX_GC+3.2989X_EGC+2.5719X_EGCG-1.0467X_EC+1.2953X_GCG+1.9433X_ECG+0.1999X_CG，决定系数R²=0.9009.偏最小二乘回归分析与Pearson分析结果一致，说明EGCG、EGC、ECG与DPPH清除力相关性最强，且呈正相关;GA与DPPH清除力呈负相关，对模型进行外部检验和内部检验，所构建模型的平均相对标准偏差为5.58%，这说明利用儿茶素HPLC指纹图谱与其抗氧化数据构建的谱效关系模型具有一定的实用价值，有望通过儿茶素HPLC指纹图谱信息预测其抗氧化活性，初步实现儿茶素抗氧化活性的高通量分析。

GA本身具有较强的抗氧化活性，卢怡雯等以GA单体进行研究，发现GA含量与DPPH清除活性呈正相关，且存在良好的线性剂量效应关系。马慧等以茶叶提取物评估其抗氧化活性，发现茶叶提取物中GA含量与DPPH清除活性的相关性为-0.71，与本研究结果一致，这可能是因为茶叶的抗氧化活性是各成分共同作用的结果，单一成分的含量及其活性指标不能真实反应茶叶的内在质量，发酵茶总体上抗氧化活性低于不发酵茶或半发酵茶，然而发酵茶中GA含量高于不发酵茶或半发酵茶。红茶抗氧化活性最弱，总酚含量最少，而GA含量最高;白茶、绿茶抗氧化活性强，总酚含量高，GA含量低。综上所述，茶叶中GA不是主要抗氧化活性成分，GA含量的变化不能主导抗氧化活性的变化，而总酚含量增减对抗氧化活性强弱有着决定性作用。