以电针对照观察针刀干预对膝骨关节炎兔股直肌的修复作用*

陈烯琳，孙学燕，马诗凝，张 伟，付昕怡，谢汶姗，郭长青△

(1.北京中医药大学，北京 100029； 2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

膝骨关节炎(Knee osteoarthritis，KOA)是膝关节的一种退行性病变[1]，高发于中老年人。KOA的发病机制尚未完全清楚，Felson[2]指出膝周组织不平衡所致的生物力学改变是发病的重要因素。而膝周组织不仅包括半月板、韧带，还包括强壮的伸屈肌。Qiestad BE等[3]进一步提出KOA与膝关节伸肌萎缩密切相关，健康的肌力对膝关节稳定至关重要[4]。针对这种存在股直肌萎缩的KOA，本团队前期研究证实了针刀干预可以抑制股直肌凋亡，并促进股直肌修复[5]。其深入的修复机制是什么？Akt/mTOR通路具有调控多种细胞的代谢、增殖和生长作用[6]，并且可有效调控萎缩的骨骼肌[7]。故本研究通过Westernblot观察Akt(又叫PKB，protein kinase B，蛋白激酶)/mTOR(mammalian target of rapamycin，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)通路及其下游p70s6k(p70 Ribosomal protein S6 kinase，p70核糖体蛋白S6激酶)的蛋白表达变化，进一步探究针刀对退行性KOA的修复机制。

1 材料与方法

1.1 动物

36只6月龄雄兔，体质量(3.20±0.2)kg，购买自北京科宇动物养殖中心(动物批号：SYXK京2016-0013，SPF级新西兰大白兔，质量合格证号：DH201601958)，本实验于中国中医科学院中药研究所完成，恒温20～22℃，相对湿度40%～60%。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 仪器 微型旋涡混合仪(VORTEX GENIN，美国SCIENTIFIC INDUSTRIES公司)；手掌型离心机(LX-100，中国Haimen Kylin-Bell实验仪器公司)；蛋白质电泳系统及转膜系统(美国 BIO-RAD公司)；摇床(TS-1，北京TAYASAF公司)；IEC低温高速离心机(美国尼通公司)；FMIOO制冰机(美国格兰特公司)；-20℃/4℃冰箱(日本三洋公司)；-80℃冰箱(中国美菱公司)；液氮罐(上海博谷公司)；电热恒温鼓风干燥箱(DH-101，北京利康有限公司)；奥豪斯电子天平(AR2130，上海恭航称重设备有限公司)；超纯水机(ZYFX-108-UP，北京盛盛科技发展有限公司)；胶片夹(北京PPLYGEN有限公司)；全波长多功能酶标仪(infinite M100，帝肯有限公司)；Chem Doc XRS+成像系统(Bio-Rad公司)；X线暗盒、D72显影粉、D72定影粉(北京PPLYGEN有限公司)；X光胶片(北京CWBIO有限公司)；水平摇床(北京市六一仪器厂)。

1.2.2 试剂 RIPA裂解液(P0013B)、PMSF(ST506)、BCA蛋白质定量试剂盒(P0010-1)(Beyotime)；蛋白彩色Marker(26616)、ECL发光液(34096)(Thermo公司)；5×蛋白上样缓冲液(B1012)、1.5M Tris·HCl缓冲液(B1001)、1.0M Tris·HCl缓冲液(B1002)、30%丙烯酰胺(B1000)、AP(A1004)、四甲基乙二胺 TEMED(A1006)、10×SDS-PAGE 电泳缓冲液(B1005)、10×蛋白电转缓冲液 10×封闭(B1006)、洗涤缓冲液(B1009)、Tween 20(A1007)(PPLYGEN有限公司)；山羊抗兔IgG(二抗)(A6154，Sigma公司)；PVDF膜(IPVH00010，Immobilon-P公司)；mTOR(2983，美国CST)；p70s6k(SC8418，美国圣克鲁斯生物技术公司)；AKT(9272，美国CST)。

1.3 分组及造模方法

1.3.1 分组 饲养1周后，采用随机数字法将36只兔随机分为正常组(N)、模型组(M)、针刀组(A)和电针组(EA)，每组9只，其中1只用于检验造模效果，其余用于指标检测。

1.3.2 造模 根据改良Videman[8]左后膝伸直位固定制动法制备KOA模型。两名研究者共同操作，将家兔仰卧固定，保持左后肢膝关节完全伸直，踝部充分背伸。先用脱脂棉包裹膝关节减缓压迫，再用树脂绷带缠绕整个家兔左后肢定型。于外层用高分子材料加固，并缠上防啃咬绷带。全程保持模具松紧适度并且外露足趾以观察肿胀瘀血情况。若模具下滑、破损予以加固，若后肢末端肿胀予以松解。6周造模结束后，用随机数法从每组选1只家兔处死，观测关节软骨的病理改变是否符合要求，造模成功则拆除固定。

1.4 干预方法

1.4.1 N组 不处理，常规饲养。

1.4.2 M组 造模成功后操作同N组。

1.4.3 A组 造模成功1周后，予以针刀干预治疗。具体干预方法：将KOA兔固定后，用标记笔点出股内、外侧肌腱以及股二头肌、股直肌周围的条索结节点，每次治疗选择2～3点。备皮消毒后，左手加压分离，右手持针刀垂直皮肤刺入，保持刀柄方向与肌腱走势相同，着重松解条索结节以及肌腱和骨面连接处，每点松解2～3刀，操作完成后拔出针刀并按压止血。治疗频次2次/周， 共4周累计8次。

1.4.4 EA组 造模成功1周后开始进行电针治疗，根据《实验针灸学》[9]选取梁丘-血海与内膝眼-外膝眼两组穴位，用毫针刺入5 mm,并用韩式穴位神经刺激仪以疏密波分别连接，进行电针治疗(电流参数：F=2/100 Hz，I=3 mA)。治疗频次10 min/次，3次/周，共4周累计12次。

1.5 检测方法及指标

1.5.1 大腿围度测量 将兔左后肢大腿备皮，一人将兔固定于操作台上，另一人持皮尺测量腹股沟下缘、髌骨上缘以及两者连线中点位置的大腿围度，记录数据。

1.5.2 取材方法 治疗结束1周后，各组家兔采用戊巴比妥进行全身麻醉，左后肢备皮干净后，于左后肢股骨近髌骨的前侧开口，仔细剥离浅层筋膜，于髌上2 cm处取肌肉，规格为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，迅速装瓶并液氮保存。

1.5.3 股直肌组织中Akt、mTOR、p70s6k蛋白表达检测 采用Western Blot进行检测，取冻存的兔左后肢的股直肌组织，研磨后，于冰上用RIPA裂解液进行裂解，离心取上层清液，BCA法测定蛋白浓度。电泳后进行电转、封闭，并用PBS稀释液稀释一抗mTOR(1/2 000)、p70s6k(1/1 000)、AKT(1/1 000),4℃孵育过夜。 0.5% Tween 20洗膜 5 次，每次5 min，然后将山羊抗兔IgG(二抗)稀释至1∶20 000。孵育后再用0.5% Tween 20洗膜5次，每次5 min。最后使 A 液与 B 液等量混合均匀，进行化学发光反应，显影后用Image Lab进行蛋白条带的数据分析。

1.6 统计学方法

所得数据采用SPSS22.0(20150408-LSBJ，北京中医药大学，中国)统计软件进行统计，检验各组数据分布的正态性与各组间方差齐性，若正态分布且方差齐则用方差分析进行统计，否则用非参数检验进行统计。以P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 各组大腿围度测量结果

腹股沟下缘M组、A组及EA组的大腿围度均显著小于N组(P<0.05或P<0.01)，A组大于M组(P<0.05)，与EA组相比，A组、M组差异均无统计学意义(P>0.05)；髌上缘各组之间大腿围度差异无统计学意义(P>0.05)；中点位置M组、A组和EA组之间的大腿围度差异无统计学意义(P>0.05)，但都显著小于N组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大腿围度测量结果

注：与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01;与模型组相比，△P<0.05。

2.2 各组股直肌Akt、mTOR、p70s6k蛋白表达

Western Blot法检测各组实验性KOA兔股直肌Akt、mTOR、p70s6k蛋白表达结果：M组较N组股直肌中mTOR和p70s6k、Akt蛋白的表达水平显著降低(P<0.01或P<0.05)；干预后Akt蛋白表达：A组与EA组相比模型组显著升高(P<0.01)；干预后mTOR蛋白表达：相比M组，A组与EA组升高(P<0.01或P<0.05)；干预后p70s6k蛋白表达：A组较M组显著升高(P<0.05)，而EA组与M组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图1～2。

表2 各组股直肌Akt、mTOR、p70s6k蛋白相对表达水平

注：与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01;与模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01。

注：与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01;与模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01。图1 各组股直肌Akt、mTOR、p70s6k蛋白相对表达量

图2 各组股直肌Akt、mTOR、p70s6k Western blot条带图

3 讨论

KOA的动物模型制备方法有很多种，目前较为常用的是关节内注射法、手术法和制动法。关节内注射木瓜蛋白酶主要通过分解软骨基质的蛋白多糖，造成软骨退变的KOA模型[10]，但与临床上因膝周力学改变引起的病变在机制上差异较大。研究指出各种原因引起的膝关节周围肌肉无力、应力不平衡是引起KOA的重要原因[11]。从这个切入点，手术法[12]与关节制动法[8]更能复刻出力学失衡的发病过程。但是手术法打开了关节囊，属于有创性造模，影响关节的初始结构。而关节制动法可使那些制动时长度比静止状态长度短的肌肉(本研究中为股直肌)出现明显的萎缩[13]，更加适合本研究的探索。故本实验沿用改良videman法进行造模。

与此同时，最新的研究也指出，股四头肌无力会增加膝骨关节炎发病的可能[14]。针对退行性KOA中肌肉无力的特点，国外的研究者从股四头肌无力入手治疗KOA，发现锻炼激活股四头肌可以有效地改善中、重度KOA患者的临床症状[15]，这与中医的治疗思路有异曲同工之秒。从中医的角度而言，郝军[16]提出“筋为骨用”的治疗思路，并且在经筋理论的指导下，众多中医方法干预KOA均取得良好的效果[17]。针刀疗法将传统针灸机械牵拉的特点与手术刀松解的特点相结合[18]，松解软组织，具有调整力学失衡、改善股直肌力学特性[19]、抑制股直肌中Bax、Caspase-3凋亡相关蛋白表达[5]从而促进股直肌的修复的作用，减缓KOA的进程。

相关研究表明Akt-mTOR可感知环境和细胞内的变化，整合各种外界信号刺激后调节细胞的生长、分化、自噬及凋亡等[6]。在肌腱损伤的动物模型中，该通路会被下调，使自噬-溶酶体系统增强，加重肌肉蛋白质的水解进而导致肌肉萎缩[20]。因此，抑制自噬-溶酶体途径可以有效地减缓肌肉萎缩，促进恢复。与此同时，近年来有研究指出，该通路可介导自噬、凋亡等多种途径调控骨骼肌蛋白质合成，预防肌肉萎缩，与骨骼肌修复密切相关[21]。在本实验中，造模之后，Akt、mTOR蛋白表达显著降低，提示造模给肌肉细胞造成应激后，激活其自噬-溶酶体系统，对局部受损细胞进行清除以维持能量代谢来对抗外界的变化，肌肉出现了萎缩。并且造模后腹股沟下缘、髌上缘大腿围度均显著小于正常组，进一步证实肌肉出现了萎缩。而针刀、电针均上调了该通路，提示股直肌的萎缩被抑制，可见两种干预均打破了KOA膝周 “力学失衡-股直肌萎缩”的恶性循环，有效地阻遏了病程进展。

p70s6k作为Akt/mTOR下游主要的效应因子，通过上游的级联激活后，可以有效地促进细胞增殖[22]。该因子的高表达不仅介导细胞中蛋白质的合成，还介导血管生成[23]。研究表明p70s6k的激活可以对骨骼肌起到保护作用，减少肌肉被破坏以及抑制细胞凋亡，对萎缩的骨骼肌有积极的作用[24]。本实验结果显示，针刀干预后股直肌p70s6k蛋白表达相比模型组显著升高，逆转了股直肌萎缩的状态，蛋白质合成升高，血管生成，呈现出修复状态，该过程由Akt/mTOR通路介导并协同完成，进一步印证针刀对股直肌的修复作用，与行为学结果相符合。而电针干预后，p70s6k蛋白表达与模型组比较差异无统计学意义，与行为学结果相印证，但与通路结果不一致，故其由akt/mTOR通路介导修复股直肌的途径尚不清楚，这可能是针刀与电针两种干预方法的差异所在，需进一步探索。

综上，针刀通过上调akt/mTOR及p70s6k的蛋白表达，修复萎缩的股直肌，改善膝周软组织的生物力学，促进膝关节的恢复。