清涧红枣乳酸菌发酵饮料工艺优化

王 鑫,马芙俊,李雅丽,吴逸民,段盛林,王维岗,李 兵,朱守创,*

(1.河北工程大学生命科学与食品工程学院,河北邯郸 056038; 2.中国食品发酵工业研究院有限公司,北京 100015; 3.功能主食创制与慢病营养干预北京市重点实验室,北京 100015; 4.清涧北国枣业有限责任公司,陕西榆林 718300)

红枣又名华枣,是鼠李科枣属植物枣树的果实,原产自我国,是中国北方栽培的主要品种之一[1]。陕北黄河沿岸是我国枣栽培的起源地,是陕西红枣主要产区和最大优良制干枣基地,栽培历史悠久,品种多样,有着“陕北大红枣”的美誉之称。清涧县的土壤和气候是红枣天然独厚的自然生长条件,其主栽区是以黄河两岸和无定河两岸为代表的县内东区土石山区[2]。在黄河流域地带培育的清涧红枣果大核小、可食部分较多、果实蛋白含量高,富含VC等多种营养成分,是良好的药用和滋补品[3-6]。早在古代中国的农书《齐民要术》中所论的42种果品中,红枣位居榜首。古代医书《本草纲目》中记载红枣“熟则可食,干则可补,丰俭可以济时,疾苦可以备药,辅助粮食以养民生”,“干红枣润心肺、止咳、补五脏、治虚损、除肠胃癖气”。枣还被称为果品中的“补品王”,具有补中益气、养血安神、生津补血、安中养脾、护肝养肾以及增强人体免疫力等医疗保健功能,深受消费者的喜爱[7-9]。但由于其营养丰富、含水量高等特点,采后极易被病原菌侵染发生软化、酒化甚至腐烂,因其不耐贮藏,急需开展枣深加工技术、提高综合利用价值[10-13]。

近年来,乳酸菌发酵型饮料是饮料发展的一种新趋势,在健康需求、美味提升、消费习惯等方面都具有广泛前景。益生菌生理功能对人体肠道功能的改善应用和免疫调节的良好效果得到了广泛认同,而发酵乳制品仍是当前益生菌的重要来源。我国于20世纪90年代开始研究果蔬乳酸饮料,虽时有苹果、红枣、核桃、南瓜、胡萝卜等乳酸饮料的研究见诸各学术期刊,但是,乳酸发酵果蔬饮料未见全国性品牌,地方性品牌也极少。现在果蔬发酵乳酸饮料还处于实验室阶段,少数申请了专利技术,成果转化不明显[14-18]。根据枣含糖量高的特点,利用乳酸菌发酵使其中的一部分糖转化成乳酸,控制好发酵程度,既起防腐作用,又可改善枣的风味,得到口感独特、营养丰富的发酵枣饮料。乳酸本身酸味柔和,在赋予食品酸味的同时,还有助于消化[15-17,19-22]。

此外,红枣中环磷酸腺苷(cAMP)含量丰富,而环磷酸腺苷(cAMP)是细胞内参与调节物质代谢和生物学功能的重要物质,对心脑血管疾病具有良好治疗效果。目前将乳酸菌复配应用于红枣汁发酵的饮料,在市面销售上很少见[23-26]。因此,本研究以红枣为原料,制备出红枣枣清汁,通过乳酸菌发酵制备出一款风味独特、营养丰富、活菌含量高的健康饮品,旨在提高陕北清涧红枣的经济价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红枣(清涧红枣) 市售;发酵菌种(干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌) 江苏微康生物科技有限公司;果胶酶、纤维素酶 北京卫诺恩生物技术有限公司;碳酸氢钠 天津红依食品有限公司;MRS琼脂培养基 北京奥博星生物技术有限公司;磷酸氢二铵 江苏克伦多食品配料有限公司;环磷酸腺苷标准品 纯度≥98%,北京索莱宝科技有限公司;甲醇 色谱纯,北京迈瑞达科技有限公司;磷酸二氢钾 色谱纯,上海安普实验科技股份有限公司。

ISO9001型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;FE20型pH计 梅特勒仪器上海有限公司;PAL-1 型数显手持式折光糖度仪 日本ATAGO;GHP-9270型隔水式恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;D2010W型电动搅拌器 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司;LD4-40型低速离心机 北京京立离心机有限公司;HC-3618R型高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;DL-CJ2NDI型超净工作台 北京松联哈尔仪器制造有限公司;SPX-150B型生化培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司;LC-6AD型高效液相色谱仪 岛津(香港)有限公司;VORTEX-5型漩涡混匀器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 枣清汁的制备 工艺流程:清涧红枣(干枣)→拣选、清洗→预煮(95 ℃、10 min)→去核→加水打浆→pH调至4.5→酶解(50 ℃、1 h)→灭酶(95 ℃、10 min)→冷却、离心分离(室温下3000 r/min、5 min)→取上清液pH调节4.5→灭菌(95 ℃、10 min)取得清汁备用。

操作要点:挑选水分约22%～25%、无腐烂变质、无病虫害的干枣,用流动的清水尽可能清除掉干枣表面的杂质;红枣与水1∶2.5 g/g在95 ℃条件下水浴10 min后去除枣核,加入预煮水进行打浆,定容红枣与水质量比1∶4 g/mL。用1 mol/L碳酸氢钠调节pH至4.5,分别添加0.125%果胶酶和0.125%纤维素酶,50 ℃酶解1 h。升温至95 ℃,灭酶5 min。在室温条件下,3000 r/min离心5 min,收集上清液。用0.5 mol/L磷酸氢二铵调节pH至4.5,95 ℃条件下灭菌10 min制得清汁备用。

1.2.2 接种及发酵 在无菌条件下将供试菌种按照一定比例接入灭菌枣清汁,于37 ℃培养箱静置培养,观察枣清汁在一定的初始可溶性固形物含量条件下发酵一定时间的pH及口感变化,当发酵饮料pH降到3.5时停止发酵。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 发酵时间对枣清汁pH和感官评价的影响 控制变量为接种菌种分别为干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌,接菌量均为0.01%,初始可溶性固形物含量为13.5%,按1.2.2所述的试验方法进行枣清汁乳酸菌发酵。通过发酵时间为0、12、24、48、72、96 h,以感官评价为评价指标,考察其对红枣乳酸菌饮料品质的影响,确定最适发酵时间。

1.2.3.2 枣清汁初始可溶性固形物含量对发酵饮料pH的影响 控制变量为乳酸发酵饮料接种菌种分别为干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌,接菌量为0.01%,发酵时间48 h。设定枣清汁初始可溶性固形物含量为12.5%、13.5%、14.5%、15.5%,按1.2.2所述的试验方法进行枣清汁乳酸菌发酵。

表1 发酵工艺因素水平表Table 1 Level table of fermentation process factors

1.2.3.3 发酵菌种和接种量对发酵饮料pH的影响 结合前期预实验效果及菌种推荐接菌量,分别接种干酪乳杆菌(0.0050%、0.0075%、0.0100%)、植物乳杆菌(0.00125%、0.00250%、0.00500%)、鼠李糖乳杆菌(0.00125%、0.00250%、0.00500%);发酵时间为48 h;初始可溶性固形物含量为13.5%,按1.2.2所述的试验方法进行枣清汁乳酸菌发酵。

1.2.4 乳酸菌发酵饮料发酵工艺正交优化试验 在单因素试验基础上进行发酵工艺L8(41×24)正交试验,选取发酵时间、枣清汁初始可溶性固形物含量、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种作为因素,发酵时间取4个水平,初始可溶性固形物含量及三个菌种各取2水平,分别以pH、感官评分为考察指标,得出枣清汁乳酸菌发酵的最佳发酵工艺条件。

1.2.5 检测分析方法 pH:采用FE20型pH计直接测定;可溶性固形物:采用手持式折光糖度仪直接测定;乳酸菌活菌数:按照GB 4789.35-2016规定执行[27];总酸按照GB 12456-2008规定执行(以乳酸计),采用酸碱滴定法[28];还原糖按照GB 5009.7-2016规定执行,采用直接滴定法[29]。

1.2.6 感官评价 邀请10名感官评价者参照表2的感官评价标准,分别从色泽、口感、香气和澄清度为评分项目,按评分要求在给定的分数内逐项打分后,满分为100分,四舍五入,以整数标度,取其平均值作为评分结果[30]。

表2 发酵红枣汁的感官评价标准Table 2 Sensory evaluation criteria of fermented jujube juice

1.2.7 HPLC测定环磷酸腺苷含量 对比清涧红枣提取的枣清汁中环磷酸腺苷含量和正交优化得出的清涧红枣乳酸菌发酵饮料的环磷酸腺苷含量,考察乳酸菌发酵条件对环磷酸腺苷含量的影响,对发酵终产品进行评判。

1.2.7.1 环磷酸腺苷含量分析 LC-6AD高效液相色谱仪中色谱柱:XTERRA® MS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:甲醇:0.05 mol/L磷酸二氢钾(20∶80,V/V);流速:0.5 mL/min;检测波长为:254 nm;柱温:40 ℃,进样量为10 μL[31-32]。

1.2.7.2 标准系列溶液的配制 用超纯水溶解配制100 μg/mL的环磷酸腺苷标准溶液,再稀释配制成1、3、5、10、15 μg/mL标准系列溶液,取各浓度标准溶液过0.22 μm有机滤膜,待测,均临用新配。

1.2.7.3 试样前处理及测定 分别准确吸取1 mL枣清汁和发酵枣汁于10 mL容量瓶,用超纯水定容,摇匀移至15 mL离心管,漩涡震荡混匀,经高速离心后过0.22 μm微孔滤膜进样,分析测定环磷酸腺苷峰面积色谱图,并计算出枣清汁与发酵枣汁中环磷酸腺苷含量。

1.3 数据处理

试验样品均重复3次,结果以(平均值±标准差)的形式表示。采用Microsoft Excel和Origin 8.6软件处理实验数据并进行统计分析、作图,差异显著性分析。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌发酵单因素实验

2.1.1 发酵时间对乳酸菌发酵饮料pH及感官评价的影响 由图1可知,随着发酵时间延长,三种不同菌种发酵饮料的pH均呈现先快后慢的下降趋势。植物乳杆菌在发酵前24 h,pH降低速度明显快于其他两菌种。但发酵至48 h,三菌种发酵饮料pH均无显著差异。在48～96 h之间,三菌种发酵饮料pH下降速度明显降低。分析原因可能是植物乳杆菌能高效利用枣汁中的碳源产酸,区别于其他两种乳酸菌的产酸量比较高。结合感官评价和pH,综合选择发酵终止时间为48 h为宜。

图1 发酵时间对发酵饮料pH影响Fig.1 Effect of fermentation time on pH of fermented beverage

对三种不同菌种发酵48 h发酵饮料进行感官评价,结果见表3。结果表明,干酪乳杆菌发酵饮料无论从色泽、口感、香气、澄清度得分都很高。植物乳杆菌发酵饮料在口感、香气、澄清度方面得分较高,但发酵饮料颜色欠佳,试验中发现植物乳杆菌样品颜色暗红,分析原因可能是植物乳杆菌菌种在发酵过程中产生了还原性糖类物质,经过37 ℃ 48 h培养,发生了美拉德褐变反应。而鼠李糖乳杆菌发酵饮料在色泽、口感、香气方面得分均较高,但样品澄清度欠佳。综合分析,干酪乳杆菌菌种作为主要发酵菌种,同时复配小比例植物乳杆菌及鼠李糖乳杆菌,在保持产品较佳色泽及澄清度前提下使得产品整体风味更加丰富饱满。

表3 乳酸菌发酵饮料感官评价结果(分)Table 3 Sensory evaluations ofLactobacillus fermented beverage(scores)

2.1.2 枣清汁初始可溶性固形物含量对乳酸菌发酵饮料pH影响 由图2可知,随着枣清汁初始可溶性固形物含量提高,干酪乳杆菌发酵饮料pH变化不显著(P>0.05)。但植物乳杆菌及鼠李糖乳杆菌发酵饮料pH呈现先降低后升高的趋势。说明初始可溶性固形物含量过低及过高均不利于两菌种进行发酵。综上所述,初步筛选初始可溶性固形物含量13.5%和14.5%。

图2 初始可溶性固形物含量对发酵饮料pH影响Fig.2 Effects of initial soluble solid contentson the pH of fermented beverage

2.1.3 发酵菌种及添加量对乳酸菌发酵饮料pH影响 由图3可知,经过48 h发酵,三菌种发酵饮料pH均随菌种添加量增加而降低。干酪乳杆菌菌种添加量为0.0050%、0.0075%、0.0100%时经过48 h发酵,发酵饮料pH分别为4.05、3.82、3.65,即干酪乳杆菌发酵饮料pH随菌种添加量增加而显著降低(P<0.05)。而干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌发酵饮料pH随着菌种添加量增加没有显著变化(P>0.05),即植物乳杆菌与鼠李糖乳杆菌在添加量分别为0.00125%、0.00250%、0.00500%时经过48 h发酵,发酵饮料pH差异不显著(P>0.05)。因此,选定干酪乳杆菌添加量0.0075%和0.0100%,植物乳杆菌添加量0.00250%和0.00125%,鼠李糖乳杆菌添加量0.0025%和0.00125%作为正交实验考察因素。

图3 发酵菌种及添加量对发酵饮料pH影响Fig.3 Effects of fermentation strain and additionamount on pH of fermented beverage注:不同小写字母相同菌株不同添加量水平差异显著,P<0.05。

2.2 清涧红枣乳酸菌发酵饮料发酵工艺正交优化

在单因素试验的基础上进行L8(41×24)正交试验,以48 h发酵饮料pH及感官评分为指标,正交试验结果如表4所示。

表4 正交试验结果及极差分析Table 4 Orthogonal experimental results and range analysis

通过R值计算,以pH为考察指标时,RA>RB>RD>RE>RC,即发酵时间>初始可溶性固形物含量>植物乳杆菌添加量>鼠李糖乳杆菌添加量>干酪乳杆菌添加量,通过各因素对感官评价得分影响为RA>RC>RD=RE>RB,即发酵时间>干酪乳杆菌添加量>植物乳杆菌添加量=鼠李糖乳杆菌添加量>初始可溶性固形物含量。结合2.1.1结果,干酪乳酸菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌发酵48 h时,pH分别为3.61、3.56、3.55,此时产品感官得分较高。pH过高说明发酵速度太慢,pH过低口感会变差。因此选定pH在3.55～3.61范围内的组合为宜,即A2B1C1D2E2和A2B2C2D1E1。以感官评定得分为指标时,RA>RC>RD=RE>RB,即发酵时间>干酪乳杆菌>植物乳杆菌=鼠李糖乳杆菌>初始可溶性固形物含量,得出最佳工艺方案是A2B1C1D2E2,此时感官得分最高。结合pH和感官评定结果,得出最佳工艺方案是A2B1C1D2E2,即添加干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖的比例为6∶1∶1。

2.3 HPLC测定环磷酸腺苷含量

2.3.1 含量的测定 由图5可以看出,环磷酸腺苷标准品保留时间是8.5 min左右,以不同标准系列浓度为横坐标,标准系列浓度峰面积为纵坐标,绘制标准曲线结果见图4。本测定方法的线性回归方程为:y=24082x-5349.3,决定系数R2=0.9998。表明环磷酸腺苷标准品的浓度与峰面积良好线性关系,浓度与峰面积之间呈现显著相关性。

图4 环磷酸腺苷标准曲线图Fig.4 Standard curve of cAMP

图5 环磷酸腺苷标品HPLC色谱图 Fig.5 HPLC chromatogram of standard cAMP

2.3.2 发酵前后环磷酸腺苷含量变化 由图6、图7可以看出,环磷酸腺苷作为枣中最具代表性的功能性成分,在枣汁发酵过程中,环磷酸腺苷含量无明显变化差异,枣清汁发酵前含量25.3 μg/mL,发酵后环磷酸腺苷含量为21.4 μg/mL,说明本研究中复合菌种发酵的条件、微生物代谢过程等因素较好地保留了发酵枣清汁的环磷酸腺苷。

图6 原清汁中环磷酸腺苷测定液相色谱图Fig.6 HPLC chromatograpm of cAMP in raw juice

图7 发酵红枣饮料中环磷酸腺苷测定液相色谱图Fig.7 HPLC chromatograpm of cAMP in fermented jujube juice

2.4 红枣发酵饮料相关指标

测得红枣发酵饮料pH3.61,可溶性固形物含量13.5%,乳酸菌活菌数≥1.5×108CFU/mL,总酸8.99 g/kg,还原糖10.46 g/100 g,符合国家轻工业局推荐性行业标准-果蔬发酵汁(QB/T 5356-2018)。

3 结论

试验研究结果表明,采用干酪乳杆菌∶植物乳杆菌∶鼠李糖乳杆菌=6∶1∶1 (m/m)复配发酵清涧红枣清汁的最优工艺为:初始可溶性固形物为13.5%,发酵温度为37 ℃,枣清汁pH为4.5,发酵时间48 h和菌种接菌量为0.01%,在此条件下得到发酵枣清汁,各项检测指标均符合标准QB/T 5356-2018果蔬发酵汁。通过HPLC对枣中主要营养成分环磷酸腺苷含量的分析,相较于发酵前的枣清汁相比,经过复配发酵后,其主要营养成分得到了较好地保留。

随着生活水平的逐渐提高,天然果蔬汁的乳酸菌发酵制品越来越受到人们的关注和喜爱。而本试验研究利用乳酸菌复配直接发酵生产清涧红枣乳酸菌饮料的工艺流程,既适应工业化生产又适合小工厂生产,加大了清涧红枣的基础研究,具有广阔的市场前景。