碱-酶结合法水解铬革屑及响应曲面法优化研究

丁绍兰， 刘艳华, 龚贵金

(1.陕西科技大学 环境科学与工程学院， 陕西 西安 710021； 2.江西正合环保集团， 江西 南昌 330000)

0 引言

近年来，中国作为最大的皮革制造国，每年都会产生超过70万吨的固体废弃物[1].制革过程中会产生大量副产品和废物，仅有20%的原料皮被转化成商业皮革，而剩余的固体废弃物中90%为胶原蛋白[2,3].这不仅浪费了蛋白资源，还对环境造成了危害.

环境污染成为全球皮革工业亟待解决的问题[4].传统的皮革固体废弃物处理方式如焚烧、填埋等不仅无法解决铬离子的污染，而且可能会对环境造成二次污染[5].因此，在发展制革清洁生产技术的同时，也要进行资源化的利用.常见的铬革屑处理方法有碱法处理、酸法处理、酶法处理、氧化法处理、配合法处理等[6].不同的处理方法有其各自的优缺点：碱水解需要在较高的温度和/或压力下使用NaOH等碱性物质进行水解[7]；酸水解会对设备造成腐蚀而无法进行推广；酶水解具有较高的专一性，反应时间短且反应条件温和，但酶对铬的耐受能力差，且处理费用较高[8].

原来对铬革屑的研究主要集中在铬回收及铬鞣剂的制备上[9].近几年，胶原多肽的提取及应用的研究也越来越多[10]，主要表现在加脂剂、涂饰剂、农业肥料上的应用.本课题通过利用一种较好的铬革屑水解工艺提取胶原蛋白，并应用于厌氧发酵产沼气.

本文首先通过单因素实验对氧化钙碱处理以及中性蛋白酶处理步骤中各项参数(投加量、时间、温度)进行优化，确定较佳的参数；再通过正交试验和响应曲面法研究各因素对铬革屑水解率影响的显著性以及各因素之间的相互作用，优化出铬革屑碱-酶结合水解法的最佳方案，为铬革屑资源化提供一定理论基础.

1 实验部分

1.1 实验药品和仪器

1.1.1 实验药品

实验所需药品如表1所示.

表1 实验药品

药品名称生产厂家铬革屑晋江秋夏皮革制造厂氧化钙天津市天力化学试剂有限公司中性蛋白酶北京奥博星生物技术有限公司硫酸西安化学试剂厂氢氧化钠天津市科密欧化学试剂有限公司硼酸天津市天力化学试剂有限公司硫酸铜天津市天力化学试剂有限公司硫酸钾天津市盛奥化学试剂有限公司甲基红-亚甲基蓝天津市天力化学试剂有限公司

1.1.2 实验仪器

THZ-82恒温水浴振荡箱，国华企业；101-1AB型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；HC-3018R高速冷冻离心机，中科中佳科学仪器有限公司；BS 224S电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；ICP-AES，电感耦合等离子发射光谱，美国THEM有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 铬革屑的预处理

将从皮革厂取得的蓝湿皮块在102±2 ℃烘干2 h，用剪刀剪碎成小块，置于4 ℃冰箱以备用.

1.2.2 实验测定方法

胶原蛋白提取率采用重量分析法进行计算[11]；用ICP-AES法测定水解液中铬含量[12]；根据水解前后铬含量变化计算脱铬率.

1.2.3 碱处理和酶处理水解铬革屑单因素优化实验

(1)碱处理的单因素优化实验

取若干250 mL锥形瓶，分别加入5 g预处理后的铬革屑和100 mL蒸馏水.称取一定量的CaO(0%、0.5%、1%、2%、4%、6%、8%)，在一定温度下(40 ℃、60 ℃、80 ℃、90 ℃)，反应一定时间后(0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h)，调节pH为7后加入3%中性蛋白酶，在40 ℃、150 r/min下恒温水浴振荡反应1 h，在8 000 r/min离心15 min.取上清液计算碱处理水解铬革屑的胶原蛋白提取率和脱铬率，并选出碱水解铬革屑的最佳反应条件.

(2)酶处理的单因素优化实验

取若干250 mL锥形瓶，分别加入5 g预处理后的铬革屑和100 mL蒸馏水.然后加入2% CaO，在80 ℃、150 r/min下恒温水浴振荡反应3 h后，调节pH为7，称取一定量的中性蛋白酶(0%、0.5%、1%、2%、3%、5%、7%)，在一定温度下(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃)，反应一定时间后(0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h)，在8 000 r/min离心15 min.取上清液计算酶处理水解铬革屑的胶原蛋白提取率和脱铬率，并选出酶水解铬革屑的最佳反应条件.

1.2.4 正交试验和响应曲面法优化碱-酶结合水解铬革屑的工艺条件

以L16(35)分别对碱处理和酶处理进行正交试验，正交分布如表2和表3所示.由正交优化得到最佳正交方案，实施正交方案.运用Box-Behnken模型进行设计试验，并将拟合的结果与优化前的参数进行比较.

表2 碱处理正交试验因素水平表

水平因素CaO投加量(A)/%CaO反应时间(B)/hCaO反应温度(C)/℃111702238033590

表3 酶处理正交试验因素水平表

水平因素酶投加量(E)/%酶反应时间(F)/h酶反应温度(G)/℃111702238033590

2 结果与讨论

2.1 碱处理和酶处理单因素参数确定

2.1.1 CaO投加量对铬革屑水解的影响

不同投加量CaO水解铬革屑的胶原蛋白提取率和脱铬率如图1所示.从图1可以看出，胶原蛋白提取率随着CaO投加量增加而增加.当CaO用量为2%时，提取率达到了79.79%，当投加量处于2%～8%时，提取率逐渐趋于稳定.这是由于胶原蛋白提取率受反应体系中OH-浓度的影响，而CaO溶于水电离出的OH-有一定限度.当CaO用量过高时，一部分Ca(OH)2生成白色沉淀，反应体系中OH-浓度不再增加，因此胶原蛋白提取率逐渐稳定[13].

从图1还可以看出，脱铬率随着CaO投加量的增加先增大后趋于稳定.当CaO投加量为2%时，脱铬率相对较高，达到89.32%，当CaO投加量为6%～8%时，脱铬率基本稳定.过高CaO的投加不仅使系统灰分增加，而且浪费材料，因此确定2%CaO为最佳的投加量.

图1 CaO投加量对胶原蛋白提取率和脱铬率的影响

此外，如图1所示，单独蛋白酶水解的胶原蛋白提取率和脱铬率分别为74.82%和75.36%.随着CaO投加量的增加胶原蛋白提取率也增加，当投加量为8%，胶原蛋白提取率达到最大85.32%，比单独酶处理提取率提高了10.5%.此时，脱铬率也达到最大，为98.82%，比单独蛋白酶水解的脱铬率大幅提高了23.46%，这表明相比于单独的酶处理，碱-酶结合处理法明显提高了铬革屑的水解效率.

2.1.2 CaO反应时间对铬革屑水解的影响

CaO反应时间对胶原蛋白提取率和脱铬率的影响如图2所示.从图2可以看出，随着反应时间的延长，胶原蛋白提取率先增加后降低.当反应时间为4 h时，提取率达到最大，为78.11%，但此时水解液中铬含量最高.

由图2还可以看出，脱铬率随着反应时间的增加而总体呈下降趋势.当反应时间为3 h时，胶原蛋白提取率为74.9%，脱铬率达到96.07%，铬含量最低，为3.686 mg/L.这是由于铬的沉淀与pH(OH-浓度)有很大的关系.反应初始，体系中OH-浓度较高，Cr(Ⅲ)与OH-络合生成Cr (OH)3被沉淀，水解液中铬含量逐渐降低.但随着反应时间的增加，Cr(Ⅲ)与OH-反应趋于平衡，Cr(OH)3部分转化Cr3+和CrO2-于水解液中相对稳定[14].反应3 h与4 h的提取率相比，仅降低了3.21%，幅度很小.因此确定反应时间3 h为CaO水解最佳时间.

图2 CaO反应时间对胶原蛋白提取率和脱铬率的影响

2.1.3 CaO反应温度对铬革屑水解的影响

不同温度下，CaO水解铬革屑的胶原蛋白提取率和脱铬率如图3所示.从图3可以看出，在一定范围内，随着反应体系温度的升高胶原蛋白提取率迅速增加.当反应温度为80 ℃时，胶原蛋白提取率达到最大，92.98%.反应体系温度大于80 ℃时，提取率逐渐降低.由图3还可以看出，脱铬率随着反应时间的增加而逐渐降低，当反应温度为40 ℃时，水解液中铬含量最低，但此时胶原蛋白提取率很差，这是由于低温条件下分子运动缓慢，不利于反应进行.当温度超过60 ℃后，脱铬率趋于稳定并稍有减少，可见反应过高不利于水解反应.因此确定80 ℃为最佳反应温度.

图3 CaO反应温度对胶原蛋白提取率和脱铬率的影响

2.1.4 酶投加量对铬革屑水解的影响

蛋白酶投加量水解铬革屑的胶原蛋白提取率和脱铬率如图4所示.从图4可以看出，随着蛋白酶投加量的增大，胶原蛋白提取率增加后趋于稳定，而脱铬率总体呈减小趋势.当蛋白酶用量3%时，胶原蛋白提取率达到92.98%，脱铬率达到88.58%，此时水解液中铬含量为10.47 mg/L，与蛋白酶用量5%相比，提取率仅相差0.112%，但铬含量约为前者的3倍.因此确定酶量3%是最佳蛋白酶投加量.

图4 蛋白酶投加量对胶原蛋白提取率和脱铬率的影响

此外，当蛋白酶用量0%时，水解铬革屑的胶原蛋白提取率和脱铬率均较低，分别为56.9%和81.4%，与投加量3%的水解结果相比，提取率和脱铬率分别增加了36.08%和7.18%.由于CaO单独水解铬革屑时，利用OH-与铬离子的配合能力大于胶原羧基离子[15].但随着蛋白酶的添加，蛋白酶对革屑蛋白质进行高效、专一水解作用，从而使得胶原蛋白提取率大幅度的提高.因此，相比于单独碱处理，碱-酶结合水解法可显著提高铬革屑的水解效果.

2.1.5 酶反应时间对铬革屑水解的影响

蛋白酶反应时间对胶原蛋白提取率和脱铬率的影响如图5所示.从图5可以看出，随着蛋白酶反应时间增长，胶原蛋白提取率先增加后降低.当反应时间为1 h时，胶原蛋白提取率达到最大，水解液中氮含量为3 493 mg/L.由图5还可知，脱铬率随着反应时间的延长变化幅度不大，水解液中铬含量在9.705～22.755 mg/L变化，可见酶反应时间对脱铬率影响不明显，因此选择1 h作为最佳蛋白酶反应时间.

图5 蛋白酶反应时间对胶原蛋白提取率和脱铬率的影响

2.1.6 酶反应温度对铬革屑水解的影响

蛋白酶反应温度对胶原蛋白提取率和脱铬率的影响如图6所示.从图6可以看出，随着反应温度的增加，胶原蛋白提取率先增加后减小并趋于平缓.反应温度40 ℃时，提取率最大，达到88.39%.温度过低时，酶活性不足，不利于酶水解反应，温度过高时，蛋白酶失活，酶水解作用减慢甚至停止，从而胶原蛋白提取率逐渐下降.从图6还可以看出，脱铬率随着反应温度的增加而基本不变，说明酶水解温度对水解液中铬含量影响不大，在40 ℃时，铬含量稍低，因此确定40 ℃为酶水解的最佳温度.

图6 蛋白酶反应温度对胶原蛋白提取率和脱铬率的影响

2.2 正交试验和响应曲面法分析优化

Box-Behnken设计及结果如表4所示.

表4 Box-Behnken设计及试验结果

2.2.1 CaO投加量与CaO反应时间交互作用的分析与优化

CaO投加量、CaO反应时间及其交互作用对胶原蛋白提取率和脱铬率的响应曲面如图7所示.从图7(a)可以看出，对于胶原蛋白提取率来说，两者(AB)交互作用极显著(P<0.000 1).在试验水平范围内，当CaO投加量和CaO反应时间分别处于1.5%～2%和2～4 h时，对水解效率有较大影响.

从图7(b)可以看出，对于脱铬率来说，两者(AB)交互作用不显著(P=0.883 6).在试验水平范围内，CaO投加量和CaO反应时间分别在2%～2.5%和2～4 h时，此时脱铬率在试验中达到最大值.

2.2.2 CaO投加量与CaO反应温度交互作用的分析与优化

CaO投加量、CaO反应温度及其交互作用对水解铬革屑的胶原蛋白提取率和脱铬率的响应曲面如图8所示.从图8(a)可以看出，对于胶原蛋白提取率来说，两者(AC)交互作用极显著(P<0.000 1)，在试验水平范围内，当CaO投加量和CaO反应温度分别处于1.5%～2.5%和75 ℃～85 ℃时，胶原蛋白提取率在试验水平中达到最大值.

从图8(b)可以看出，对于脱铬率来说，两者(AC)交互作用不显著(P=0.877 1)，当CaO反应温度为80 ℃时，脱铬率在试验内达到最大值.当温度处于70 ℃～80 ℃时，脱铬率不断增大，随着温度的继续升高，脱铬率逐渐降低.在试验水平范围内，当CaO投加量和CaO反应温度分别处于1.5%～3%和75 ℃～85 ℃时，脱铬率在试验内达到最大值.

2.2.3 CaO反应时间与CaO反应温度交互作用的分析与优化

CaO反应时间、CaO反应温度及其交互作用对胶原蛋白提取率和脱铬率的响应曲面如图9所示.由图9(a)可见，对于胶原蛋白提取率，两者(BC)交互作用极显著(P<0.000 1).在试验水平范围内，当CaO反应时间和CaO反应温度分别处于2.5～5.5 h和70 ℃～85 ℃时，胶原蛋白提取率达到最大值.

由图9(b)可见，对于脱铬率，两者(BC)交互作用显著(P<0.011 6).当CaO反应时间和CaO反应温度分别处于1～4 h和80 ℃～85 ℃时，脱铬率达到最大值.

(a)CaO反应时间与CaO反应温度交互作用对胶原白提取率的响应曲面

(b)CaO反应时间与CaO反应温度交互作用对脱铬率的响应曲面图9 CaO反应时间与CaO反应温度交互作用对胶原蛋白提取率和脱铬率的响应曲面

2.2.4 酶投加量、酶反应时间和酶反应温度交互作用的分析与优化

酶投加量、酶反应时间和酶反应温度及其交互作用对胶原蛋白提取率的响应曲面如图10所示.酶投加量和酶反应时间交互作用(图10(a)：EF，P=0.967 8)、酶反应时间和酶反应温度交互作用(图10(b)：FG，P=0.712 4)、酶投加量和酶反应温度交互作用(图10(c)：EG，P=0.232 6)，均不显著.

在试验水平范围内，当酶投加量和酶反应时间分别处于0.9%～1.3%和4～5 h时、酶反应时间和酶反应温度分别处于4～5 h和35 ℃～45 ℃时、酶投加量和酶反应温度分别处于0.9%～1.1%和35 ℃～45 ℃时，胶原蛋白提取率达到最大值.对于脱铬率来说，酶投加量、酶反应时间和酶反应温度之间没有交互作用.

通过响应曲面分析，确定碱-酶结合法水解铬革屑最佳工艺条件，即为：CaO投加量2.1%、CaO反应时间3.3 h、CaO反应温度79.7 ℃、酶投加量5.6%、酶反应时间1.2 h、酶反应温度48.6 ℃.优化后胶原蛋白提取率和脱铬率分别达到99.14%和98.9%.

3 结论

(1)通过单因素实验探究碱水解铬革屑和酶处理铬革屑的最佳工艺参数：碱水解铬革屑最佳条件为CaO用量2%、CaO反应时间3 h、CaO反应温度80 ℃，酶水解铬革屑最佳参数为酶用量3%、酶反应时间1 h、酶反应温度40 ℃.水解液中铬含量最低达到3.686 mg/L.

(2)通过响应曲面优化试验确定铬革屑水解的最佳工艺条件，即为：CaO投加量2.1%、CaO反应时间3.3 h、CaO反应温度79.7 ℃、酶投加量5.6%、酶反应时间1.2 h、酶反应温度48.6 ℃.优化后胶原蛋白提取率和脱铬率分别达到99.14%和98.9%，比优化前分别增加了6.16%和2.83%.

(3)过响应曲面优化试验确定各因素之间的相互作用结果，结果表明：AB、AC、BC的交互作用对于胶原蛋白提取率有着显著的影响，而EF、EG、FG的交互作用对水解效果影响不显著，影响效果依次为FG>EG>EF.AB和AC之间的交互作用对水解脱铬影响不明显，但BC的交互作用对脱铬效果有一定影响，酶水解对脱铬效果没有交互作用的影响