液相色谱-高分辨质谱法同时测定羊肉中12种兽药残留

贾 玮， 徐 曦， 石 琳， 许秀丽， 张 峰

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021; 2.中国检验检疫科学研究院， 北京 100123)

0 引言

磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类兽药在养殖业中广泛应用[1].2019年，国家市场监督管理总局通告了多起兽药违规使用导致的肉类食品中兽药高残留超标问题，国家食品安全“十三五”规划对兽药残留的综合治理工作提出了要求，并引起社会的关注[2].肉类基质复杂，开发针对羊肉等基质复杂体系中兽药提取、净化与富集的前处理方法是药物残留分析的关键点[3].碳纳米管(MWCNTs)是一种以碳为基础的纳米材料，具有非极性，经磁化后，表面含有的多个π电子增强其疏水性在溶液中均匀分散，以结合羟基、羧基等基团改变自身表面活性，通过π-π作用力、疏水作用及共轭结构对痕量分析物产生强烈吸附作用，通过施加外部磁场力实现吸附剂与样品溶液的迅速分离.磁性MWCNTs的固相萃取常用于反相净化体系，适用于复杂样品的分离及测定[4,5].

本研究将乙二醇还原法结合水热法制备磁性修饰碳纳米管磁性复合纳米材料(Fe3O4@O-MWCNTs)用于净化羊肉基质，利用静电场轨道阱技术的液质联用系统，建立了一种同时检测多种兽药残留的方法，为兽药残留的靶向筛查、结构鉴定提供了技术支持.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈、甲酸，购自德国Merck公司；浓硫酸、浓硝酸、六水合三氯化铁、乙二醇、聚乙二醇、无水乙酸钠，购自新泰化玻试剂公司；磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺二甲氧哒嗪、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、泰乐霉素、红霉素、罗红霉素、林可霉素标准品，购自德国Dr.Erenstofer公司；MWCNTs，纯度>97%，直径10～30 nm，长度5～15μm，购自阿拉丁生化科技有限公司；羊肉，购自西安市本地超市.

1.2 仪器与设备

UltiMate3000-Q-Exactive超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱；AL204-IC型分析天平；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；Vortex Genie2T型旋涡混合器(美国Scientific Industries公司)；真空干燥箱(上海一恒仪器公司)；TGL-16C型高速离心机(湘仪离心机仪器有限公司).

1.3 标准溶液的配制

分别称取适量标准物质置于10 mL容量瓶中，用甲醇配制成质量浓度为100μg/mL的标准储备液，移取适量标准储备液，用甲醇稀释并定容至10 mL棕色容量瓶，配制相应浓度的混合标准工作液于-20 ℃冷冻保存；以空白样品提取液逐级稀释混合标准工作溶液，制备基质匹配标准溶液.

1.4 色谱质谱条件

色谱柱：Hypersil Gold aQ C18(100 mm×2.1 mm,1.9μm)；柱温：35 ℃；流动相：A为0.1%(体积分数，下同)甲酸-4 mmol/L甲酸铵溶液，B为0.1%甲酸-4 mmol/L甲酸铵-甲醇溶液；流速：0.3 mL/min；梯度洗脱程序：0～1 min，100% A、1～7 min，100%～0% A、7～12 min，0% A、12～13 min，0%～100% A、13～15 min，100% A；进样量：5μL；质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压：3 500 V；碰撞气：N2；干燥气流量：13 L/min；离子源温度：350 ℃；鞘气流量：12 L/min；辅助气流量：3 L/min.12种兽药质谱信息见表1.

表1 12种兽药的色谱-质谱参数

1.5 材料的制备

磁性碳纳米管(Fe3O4@O-MWCNTs)的制备由以下两步完成.

(1)氧化碳纳米管(O-MWCNTs)的制备

在含有10 mL浓硝酸、30 mL浓硫酸的250 mL烧杯中加入5 g MWCNTs，磁力搅拌下反应4 h后，采用离心法从酸液中分离，用超纯水冲洗至中性后过滤，在60 ℃真空干燥箱中烘干10 h，制得O-MWCNTs，固体研磨呈粉末备用.

(2)磁性碳纳米管(Fe3O4@O-MWCNTs)的制备

Fe3O4@O-MWCNTs采用乙二醇水热还原法进行制备[6].称取1.5 g六水合三氯化铁与2 g O-MWCNTs悬浮在75 mL的乙二醇溶液中，再分别加入3.6 g无水乙酸钠、1.8 g聚乙二醇溶解，涡旋3 min、超声10 min后，继续搅拌至混合均匀，将上述混合溶液转至100 mL高压反应釜的聚氟乙烯内衬中，将反应釜在200 ℃下反应12 h左右，将其冷却至室温后采用磁铁分离，用超纯水多次冲洗至中性，于真空干燥箱70 ℃下烘干，研磨后备用.

1.6 样品前处理方法

(1)提取

称取绞碎均匀的羊肉样品2 g(精确至0.01 g)于50 mL塑料离心管中，分别加5 mL0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine(柠檬酸缓冲液)、1%甲酸-乙腈溶液振荡提取2 min，5 000 r/min离心5 min，收集上清液；残渣中再分别加入5 mL提取液，于20 ℃超声水浴超声20 min后，离心5 min，合并两次提取液过0.22μm滤膜后用于净化.

(2)净化

取一定量提取液，加入50 mg Fe3O4@O-MWCNTs涡旋混匀后，采用HCL或NaOH调pH至5，萃取10 min，用磁铁分离出萃取剂，采用1.5 mL 0.1%甲酸-甲醇洗脱后收集洗脱液，经0.22μm滤膜过滤，上机测定.净化流程如图1所示.

图1 样品净化流程图

2 结果与讨论

2.1 合成材料的表征

通过扫描电子显微镜(SEM)对材料表面形态进行表征.从图2、图3可清晰地观察到，MWCNTs和经Fe3O4修饰后材料的表面形态、结构与孔径分布，对比可见，原始MWCNTs呈光滑的中空管束状，磁化修饰后生成的Fe3O4尺寸大小基本一致的球状颗粒较好的吸附在MWCNTs的表面并无团聚现象.

图2 MWCNTs 的SEM图谱

图3 Fe3O4@O-MWCNTs的SEM图谱

图4为磁化后MWCNTs的X射线衍射(XRD)图谱.图中出现Fe3O4相近的6个特征衍射峰，2θ分别为12.88、17.61、30.02、35.95、57.96、64.98，同时保留了MWCNTs特征峰25.54、44.85，表明Fe3O4成功地积聚在MWCNTs的表面并未破坏MWCNTs的结构.

图4 Fe3O4@O-MWCNTs的XRD图谱

将磁性材料在室温下用磁力计进行磁滞回线(VSM)测试，图5中Fe3O4@O-MWCNTs的磁滞回线图显示出几乎为零的矫顽力和剩磁，最大饱和磁化强度为88.4 emu·g-1，表明材料具有超磁导率和高饱和磁化强度，使其在外部磁场的作用下高效的从样品介质中分离出来从而实现磁固相分离[7].

图5 Fe3O4@O-MWCNTs的VSM图谱

2.2 磁固相萃取条件(MSPE)的优化

MSPE通过涡旋或振荡使磁性吸附剂在样品溶液中分散，在磁力作用下实现分析物的快速转移，吸附和洗脱过程是影响磁固相萃取效果的关键，主要影响因素有洗脱条件、吸附剂的量、溶液pH、吸附时间，评价方法为MSPE后洗脱溶剂中目标分析物的总量与MSPE前标准溶液中目标分析物总量之比，实验中对以上参数进行了考察[8].

2.2.1 洗脱条件的优化

洗脱溶剂的种类及用量是影响萃取率的重要因素之一[9].磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类药物均含有碱性氨基，易溶于极性有机溶剂，在酸性条件下易获得质子.依据相似相溶原理，分别考察了单相极性溶剂(甲醇、乙腈)、弱酸水溶剂(0.1%甲酸-水)及弱酸缓冲液(0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈)5种洗脱溶剂对12种药物的洗脱效果，结果如图6所示.由图6可知，0.1%甲酸-甲醇萃取率最高，因此选择0.1%甲酸-甲醇作为洗脱溶剂[10-12].

图6 洗脱溶剂的类型对萃取的影响

实验进一步考察0.5～3.5 mL不同体积0.1%甲酸-甲醇的萃取效果，由图7可见，洗脱溶剂体积的增加，萃取率显著提高，当体积达到1.5 mL时，萃取率最高，再继续增大洗脱剂体积，萃取率逐渐降低.因此，综合考虑选择最佳洗脱溶剂体积为1.5 mL.

图7 不同体积0.1%甲酸-甲醇对萃取率的影响

2.2.2 吸附剂量的优化

为实现多组分分析物快速有效的富集，对吸附剂的用量进行优化.图8显示， 当Fe3O4@O-MWCNTs的量从10 mg增加至50 mg，12种兽药萃取率显著增加，当吸附剂的量增至60 mg时萃取率减小，为提供更多吸附位点保证吸附完全，实验选择50 mg Fe3O4@O-MWCNTs作为MSPE过程吸附剂的量.

图8 吸附剂量对萃取率的影响

2.2.3 pH的优化

溶液的pH影响目标分析物的化学性质、吸附剂表面电荷的密度与类型，实验研究了pH2～8范围内吸附剂对萃取率的影响.因强酸性pH环境下，12种兽药主要以非离子化形式存在，在碱性环境下主要以去质子化形式存在，MWCNTs表面负载的部分磁性纳米颗粒会发生溶解，图9所示，pH由酸性至弱酸性(2～5)，12种化合物萃取率显著增加；pH由弱酸性至碱性(5～8)，萃取率逐渐减低.因此，pH为6作为最佳条件.

图9 pH对萃取率的影响

2.2.4 吸附时间的优化

吸附时间是MSPE的重要参数之一，常以延长吸附时间以达到萃取平衡提高萃取率[13].通过涡旋辅助，在Fe3O4@O-MWCNTs用量为50 mg，洗脱溶剂为0.1%甲酸-甲醇，洗脱体积1.5 mL，pH为5的吸附条件下，研究了不同时间(1～13 min)萃取率随时间变化的影响.由图10可知，当吸附时间为10 min时，Fe3O4@O-MWCNTs对12种药物的萃取率达到最高值.因此，萃取时间选择为10 min.

图10 吸附时间对萃取率的影响

2.3 Fe3O4@O-MWCNTs循环性实验

Fe3O4@O-MWCNTs具有反复吸附-脱附的性能，实验研究其吸附12种兽药循环使用次数.吸附完成后，使用乙腈和水依次洗涤Fe3O4@O-MWCNTs 3次后于烘箱70 ℃下烘干，按“1.6”步骤进行实验.结果显示，材料可重复使用至少10次，回收率偏差小于12%，说明此材料具有较好的循环性.

2.4 基质效应

通过比较空白基质匹配标准溶液和纯溶剂标准溶液的响应值差异评价基质效应.在空白羊肉基质提取液中添加混合标准溶液，以基质效应(ME)=(1-基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率)×100%计算目标物的基质效应[14].结果表明，12种兽药ME的绝对值在20%～50%之间，表明存在中等强度的基质效应.因此，实验通过基质匹配法进行定量分析，减弱基质效应.

2.5 方法学考察

2.5.1 线性范围及检出限

分别添加1μg/L、5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L的目标化合物混合标准物质于空白基质中，以各物质的响应峰面积对应的质量浓度绘制工作曲线.结果表明，12种化合物在1～200μg/L呈良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.99.在空白液中添加系列浓度的12种兽药混标溶液，分别以3倍信噪比确定检出限，以10倍信噪比确定定量限，结果见表2，12种化合物的检出限为0.09～5.29μg/kg.

2.5.2 回收率与精密度

分别在阴性羊肉样品中添加低、中、高3个水平的12种目标化合物混合标准溶液，按照“1.6”处理后检测分析，每个水平进行6次试验.结果表明，12种化合物的平均回收率为71.37%～94.65%，相对标准偏差为0.35%～6.37%(见表2).其准确度与精密度能满足残留检测的要求，表明该方法可靠、准确，适合此类物质的定量分析.

2.6 实际样品测定

应用本研究建立的方法对市售23批次羊肉进行筛查，采用精确质量数与保留时间对样品中12种兽药定性筛查，结合二级特征碎片离子进行确证，检出一份阳性样品含有磺胺二甲氧嘧啶，含量为1.3μg/kg.

表2 羊肉中12种兽药的线性关系、检出限、回收率及相对标准偏差

3 结论

本研究将Fe3O4@O-MWCNTs作为吸附剂用于富集羊肉中12种兽药，通过优化磁固相萃取方法，结合超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱(UHPLC-Q-Orbitrap MS)，极大地提高了萃取率与检测方法的灵敏度，实现了对复杂基质多种药物残留的快速筛查与定量.