弥漫大B细胞淋巴瘤中NF-κB/p65、PD-1、PD-L1表达相关性研究及其蛋白表达的临床意义

贵州医科大学病理学教研室，贵州 贵阳 550004

弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是B细胞非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）中最常见的亚型，尽管R-CHOP、DA-EPOCH-R等方案治疗有效，仍有30%以上的患者复发或转变成难治性淋巴瘤［1］。目前认为核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路激活是DLBCL的重要发病机制，其中NF-κB扮演着关键角色，尤其是活化细胞来源弥漫大B细胞淋巴瘤（activated B-cell like-DLBCL，ABC-DLBCL）［2-3］；程序性死亡受体1（programmed cell death-1，PD-1）及其配体（programmed cell death ligand-1，PDL1）与肿瘤细胞免疫“逃逸”相关，临床资料统计发现DLBCL患者若高表达PD-1、PD-L1其生存预后均较差［4-6］。多项体外细胞学实验发现在胃癌、乳腺癌、T细胞淋巴瘤中NF-κB的激活能促进或调节PD-L1的表达［7-9］。目前，在DLBCL中NF-κB通路与PD-1/PD-L1通路是否存在“串话”（crosstalk）尚未见报道；因此，本研究收集DLBCL患者随访数据和临床病理学资料，并采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）、普通免疫组织化学及免疫组织化学双标记染色检测患者蜡块组织中相关mRNA和蛋白水平，初步分析其与患者临床病理学参数之间的关系及生存预后的价值。

1 资料和方法

1.1 研究对象

回顾性收集贵州医科大学附属医院病理科2010年1月1日—2017年12月31日DLBCL患者的组织蜡块及其临床数据；选取直径大于0.5 cm、组织丰富且明确诊断为DLBCL的90例蜡块进行实验。

1.2 主要试剂

一抗（均为单克隆抗体）PD-1、PD-L1和NF-κB/p65购自美国Abcam公司；一抗Pax5，二抗试剂盒（PV-9001、PV-9102）及显色剂（DAB和AP-Red）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。R N A 提取试剂盒购自厦门艾德生物医药科技股份有限公司；SYBR Green荧光染料、反转录试剂盒、内参均购自宝生物工程（大连）有限公司；PD-1、PD-L1引物购自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 PV二步法检测p65、PD-1蛋白并根据p65结果分组

蜡块切片4 μm厚，脱蜡、水化、修复抗原（EDTA pH为8.0），按试剂盒进行一抗温育过夜（p65和PD-1分别以1∶2 000、1∶300稀释）；DAB显色后进行判断，以扁桃体组织作为阳性对照，阴性对照以PBS（pH为7.35）替代一抗。

1.3.1 p65判读

肿瘤细胞的细胞质或细胞核出现棕黄色颗粒为蛋白表达，据参考文献［10］采用阳性细胞所占比例及染色强度评分（肿瘤阳性细胞占比：无细胞阳性为0分，＜10%阳性为1分，10%～40%阳性为2分，＞40%阳性为3分；染色强度：无染色为0分，浅棕色为1分，棕黄色为2分，深棕色为3分），最终得分为二者的乘积，定义得分0～4分为p65低表达组，6～9分为高表达组。

1.3.2 PD-1判读

PD-1表达于肿瘤组织的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）细胞核，该部位出现棕黄色颗粒为蛋白表达，采用计量方法，随机选择10个不重复400倍视野，每个视野随机计数400个细胞，统计阳性细胞比例，取所有视野的平均值作为该例表达率，并取所有病例表达率的均数为“截断值”（cutoff值），大于或等于该阈值定义为PD-1阳性，否则为阴性［11］。

1.4 免疫组织化学双标记染色检测PD-L1的表达

同1.3方法DAB显色PD-L1蛋白后，再以EDTA（pH为9.0）修复，按SAP-9102试剂盒步骤用AP-Red显色剂检测Pax5蛋白，透明封片后进行图像采集并分析。PD-L1、Pax5阳性对照分别为乳腺癌组织、扁桃体组织，阴性对照以TBS（pH为7.35）替代一抗，以TBS作为缓冲液及冲洗液。

细胞膜呈棕黄色且细胞核呈红色为肿瘤细胞PD-L1蛋白表达，细胞膜呈棕黄色但细胞核未呈红色为肿瘤微环境细胞PD-L1（PD-L1 of tumor microenvironment cells，mPD-L1）（即TIL的PDL1）蛋白表达；采用同PD-1一样的计量方法，统计PD-L1在肿瘤细胞或在微环境细胞上的表达率；定义肿瘤细胞表达率≥截断值为PD-L1阳性［11］；另外在PD-L1阴性的DLBCL病例中，若PD-L1于微环境细胞（即TIL）表达率≥20%，定义为mPD-L1阳性［12］。

1.5 RNA提取、反转录、RTFQ-PCR检测

RNA提取、反转录：取8 μm组织进行脱蜡、蛋白酶消化处理，据RNA提取试剂盒步骤提取RNA，并用DEPC水溶解RNA，DEPC于核酸定量仪调零后，检测RNA浓度及纯度，取D值（D260nm/D280nm）在1.8～2.0的样本往下进行实验。按宝生物工程（大连）有限公司RR47A试剂说明，先进行去除基因组DNA（42 ℃2 min），于冰上配置反转录体系后进行反转录（37 ℃ 30 min，再加热至85 ℃ 5 s），缓慢冷却分装后于-80 ℃冰箱保存。

RTFQ-PCR反应：分p65蛋白高表达组和低表达组配置反应体系，据宝生物工程（大连）有限公司RR820A试剂盒说明，取cDNA样本于冰上配置SYBR Green RTFQ-PCR反应体系，PD-1上游引物为5’-GCGTGACTTCCACATGAGC-3’，下游引物为5’-GCAGGCTCTCTTTGATCTGC-3’；PD-L1上游引物为5’-CTATGGTG GTGCCGACTACA-3’，下游引物为5’-TGC TTGTCCAGATGACTTCG-3’，各组中每个样本设置复孔3个（先配置总反应体系，再分装3个复孔）；以β-actin（上游引物为5’-TAGTTGCG TTACACCCTTTCTTG-3’，下游引物为5’-TCA CCCTTCACCGTTCCAAGTTT-3’）作为内参，于Bio-Rad CFX connect RTFQ-PCR仪上进行反应（反应条件：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃5 s，退火/延伸为60 ℃ 30 s，重复50个循环），以2-ΔΔCt值为mRNA相对表达量计算［13］（ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt样本-ΔCt组内最低值）。

1.6 统计学处理

SPSS 17.0软件进行统计运算；计数资料组间差异性比较用四格表卡方检验；相关性分析用Spearman秩相关；组间mRNA均值差异比较采用t检验，且正态分布用表示，偏态分布数据经（lg10）转化为正态分布后用（10lgχ±10lgS）表示；生存分析采用Kaplan-Meier曲线表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料

DLBCL共90例，年龄17～82岁（中位年龄58.5岁），其中男性47例，女性43例；据Hans分型，14例为GCB型，76例为non-GCB型，＜60岁48例，≥60岁42例，Ⅰ+Ⅱ期49例，Ⅲ+Ⅳ期41例，25例有B症状，国际预后指数（international prognostic index，IPI）评分0～2分组、3～5分组分别为51例、39例，51例检查血清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH），42例检查β2微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）。

2.2 p65蛋白高表达与PD-1、PD-L1蛋白的相关性

如表1所示，90例样本中p65高表达占61.11%（55/90），PD-1阳性率为32.22%（29/90），肿瘤细胞PD-L1阳性率为24.44%（22/90），mPD-L1阳性率为28.89%（26/90)；p65高表达与PD-1蛋白表达无相关性（γ=0.160，P=0.132）；但p65高表达与肿瘤细胞和肿瘤微环境细胞表达PD-L1蛋白相关（γ=0.242，γ=0.295；P=0.022，P=0.015）。H-E染色、p65、PD-1、PD-L1蛋白表达见图1。

表1 90例DLBCL患者中p65蛋白表达与PD-1、PD-L1蛋白的相关性Tab.1 The correlation between p65 protein and PD-1,PD-L1 proteins in 90 DLBCL patients

图1 DLBCL的H-E染色和免疫组织化学染色结果Fig.1 Hematoxylin-eosin staining and immunohistochemical results of DLBCL

2.3 肿瘤细胞PD-1表达与mPD-L1表达的关系

肿瘤组织浸润T细胞表达PD-1与肿瘤细胞表达PD-L1显著相关（γ=0.272，P=0.010），但肿瘤组织浸润T细胞表达PD-1与微环境细胞（即TIL）表达PD-L1无相关性（γ=0.035，P=0.777，表2）。

表2 90例DLBCL患者中PD-1蛋白与PD-L1蛋白相关性Tab.2 The correlation between PD-1 protein and PD-L1 protein in 90 DLBCL patients

2.4 PD-1、PD-L1相对mRNA表达量在不同p65蛋白量组间比较

采用RTFQ-PCR检测PD-1、PD-L1的mRNA，经统计PD-1 mRNA相对表达量均值在P65蛋白低表达组（0.974 0±0.545 5）与高表达组均值（1.084 3±0.499 8）相比差异无统计学意义（t=-0.985，P=0.327）；但PD-L1 mRNA相对表达量均值在P65蛋白低表达组（1.1520±0.537 9）与高表达组（1.525 9±0.844 6）间差异有统计学意义，且高表达组相对较高（t=-2.566，P=0.012，表3）。

表3 不同P65蛋白表达量组别中PD-1、PD-L1 mRNA相对表达量比较Tab.3 Comparison of relative mRNA expression levels of PD-1 and PD-L1 in different groups of P65 protein content

2.5 p65、PD-1、PD-L1、mPD-L1蛋白表达与临床病理学特征的关系

p65蛋白表达在不同性别、年龄、Ann Arbor分期、B症状、IPI评分、LDH、β2-MG组中差异均无统计学意义（P＞0.05），但在不同Hans分型组中存在差异，且non-GCB组表达率相对较高（P=0.007）；PD-1表达在不同性别、年龄、Hans分型、Ann Arbor分期、B症状、LDH、β2-MG组中差异均无统计学意义（P＞0.05），但PD-1蛋白表达在不同的IPI评分组中差异有统计学意义，且3～5分组阳性率相对较高（P=0.044）；肿瘤细胞表达PD-L1蛋白在不同性别、年龄、Hans分型、Ann Arbor分期、LDH、β2-MG组中差异均无统计学意义（P＞0.05），但在不同IPI评分、B症状组中差异有统计学意义（P=0.007，P=0.001），即若肿瘤细胞表达PDL1，患者IPI评分较高且易出现B症状；此外，肿瘤微环境细胞（即TIL）表达PD-L1蛋白在以上不同组别中差异均无统计学意义（P＞0.05，表4～5），临床资料见2.1。

2.6 p65、PD-1、PD-L1、mPD-L1蛋白表达与患者的生存分析

在90例DLBCL患者中，患者存活36例，死亡34例，失访20例；中位存活时间38个月；其中60例接受R-CHOP治疗，余不详；Kaplan-Meier生存分析结果显示，p65高表达组患者总生存期（overall survival，OS）明显短于p65低表达组（P=0.038）；PD-1阳性组患者OS明显短于PD-1阴性组（P=0.015）；PD-L1阳性组患者OS明显短于PD-L1阴性组（P=0.028）；mPD-L1阳性组患者OS明显短于mPD-L1阴性组（P=0.010，图2）。

表5 90例DLBCL患者中肿瘤细胞和微环境PD-L1表达与临床病理特征的关系Tab.5 Relationship between expression of PD-L1 or mPD-L1 and clinicopathological characteristics in 90 DLBCL patients

图2 DLBCL中不同组患者生存曲线比较Fig.2 Comparison of survival curves between different groups of patients in DLBCL

3 讨 论

DLBCL具有明显的侵袭性及异质性，随着对其不断的深入研究和了解，针对该疾病的认识不再只是传统的细胞形态学及细胞起源，而是更加注重基因改变或信号转导通路激活对该疾病的影响［14］。

目前研究认为，NF-κB通路在淋巴瘤的发生和进展以及放化疗抵抗中起重要作用，尤其是非生发中心来源（non-GCB）型DLBCL［2-3，11］。Davis等［15］在活化后细胞来源DLBCL细胞株离体实验中发现 IKK激酶活性、NF-κB DNA绑定的活性及RAP活性与激活NF-κB通路有关，NF-κB通路激活是患者预后不良的原因之一。PD-1、PD-L1分别为染色体2q37、9p24.2上基因编码的一对负性共刺激分子，二者共同介导细胞凋亡及肿瘤细胞的免疫逃逸；Kiyasu等［6］、Liu等［12］团队分别检测1 253例和92例DLBCL患者发现，PD-L1蛋白主要表达于non-GCB型DLBCL患者，且均与患者OS显著相关。目前关于NF-κB通路与PD-1/PD-L1通路是否存在串话（crosstalk）的研究较少，尤其临床肿瘤研究中尚未见报道。

既往，Li等［7］在胃癌的离体细胞学实验中使用P65 siRNA对NF-κB/p65基因进行敲出能显著降低PD-L1的mRNA及蛋白表达，通过构建不同PD-L1基因启动子，发现PD-L1启动子含有一些有效的p65结合元件，提示p65可以作为转录因子直接上调PD-L1基因表达；此外，还有体外细胞研究［8-9］在乳腺癌及T细胞淋巴瘤细胞系中证实NF-κB的激活可以促进PD-L1的表达；本次实验检测DLBCL蜡块肿瘤组织NF-κB/P65、PD-L1蛋白发现：无论肿瘤细胞还是肿瘤微环境细胞（即TIL）表达PD-L1蛋白均与NF-κB/P65蛋白高表达显著相关；进一步通过RTFQ-PCR检测NF-κB/P65蛋白高表达组与低表达组PD-L1的mRNA发现PD-L1 mRNA在两组间存在显著差异，且NFκB/P65蛋白高表达组PD-L1 mRNA相对表达量较高。既往实验和本研究都提示，DLBCL中PD-L1蛋白及mRNA上调表达与NF-κB/P65蛋白有关。

Yao等［16］在小鼠脊髓损伤后的炎症反应模型中发现，PD-1缺乏可以促进NF-κB的激活；但本研究中NF-kB/P65高表达与PD-1蛋白及mRNA均未见相关性。

另外，在本研究中P65、PD-1、PD-L1蛋白表达均与患者OS相关；肿瘤细胞PD-L1阳性患者的IPI评分相对较高且易出现B症状；P65主要在non-GCB来源的DLBCL中表达，这些结果都与文献报道相符合［6，12］。本实验随访数据及既往研究结果都提示，P65、PD-1和PD-L1蛋白表达与患者生存预后有关，这些蛋白表达对临床及生存预后评估都具有潜在价值；但在本次实验中PD-L1的表达在不同的Hans分型组中差异无统计学意义，这可能是样本量相对较小或者PD-L1蛋白判读的cutoff值不同所致。

作为回顾性研究，本实验样本量相对较小，结果与大样本研究相比可能存在偏倚；另外，本实验RNA的提取，使用的部分组织存储时间较长，可能会存在部分RNA降解的情况。

综上所述，DLBCL中PD-1蛋白和mRNA表达与p65蛋白高表达不相关，但PD-L1蛋白及mRNA上调表达均与p65蛋白高表达相关；P65、PD-1和PD-L1蛋白表达与这类淋巴瘤不良预后特别是OS有关，它们在这类淋巴瘤预后评估中的价值有待进一步研究证实。