新疆ABCG2基因多态性与乳腺癌复发的相关性研究

新疆医科大学第三临床医学院淋巴瘤乳腺科，新疆 乌鲁木齐 830000

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，也是女性癌症相关死亡的主要原因［1］。随着医学技术的进步及乳腺癌早期筛查理念的普及，早期乳腺癌患者的生存率已有明显提高。然而乳腺癌的诊断和临床管理复杂化体现在乳腺癌在肿瘤发展的早期阶段即有恶性肿瘤细胞进入血液循环的倾向，从而形成转移性病变。复发转移是影响乳腺癌患者预后的关键因素，其涉及的病理学机制复杂，临床上尚未开发出早期监测的生物学标志物。化疗、放疗、内分泌治疗及靶向治疗是乳腺癌的主要治疗方式，但肿瘤细胞的多药耐药性是导致治疗失败的主要原因。肿瘤的多药耐药机制尚不清楚，因此解析多药耐药与基因多态性的关系对于增强药物的敏感性及改善患者的预后均具有十分重要的意义［2-4］。

乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）是体内重要的跨膜外排转运体，是目前研究多药耐药性的热点蛋白之一。在正常人体组织中，BCRP在胎盘合胞体滋养层、肠上皮、肝细胞、脑微血管内皮细胞和肾近曲小管上皮细胞的顶端膜上高度表达，有助于吸收、分布、消除药物和内源性化合物［5］。目前，已发现200多种化疗药物为BCRP的底物，如米托蒽醌或蒽环类药物，可致化疗耐药；对多个酪氨酸激酶抑制剂，如拉帕替尼、奥拉帕尼等有较强的外排能力，可导致靶向耐药［6］。目前已知BCRP的编码基因三磷酸腺苷结合盒家族G2（adenosine triphosphate-binding cassette family G2，ABCG2）上有超过80个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点，并且部分SNP位点与化疗药物的敏感性之间存在联系［7-8］。本研究以新疆地区女性乳腺癌患者为对象，采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和测序技术对ABCG2基因的rs2231142、rs2231137、rs2032582和rs1045642位点进行分析，并进行组间比较，以明确该基因与新疆地区乳腺癌复发之间的相关性。

1 材料和方法

1.1 一般资料

收集2014年12月—2015年12月首诊于新疆医科大学第三临床医学院且组织样本石蜡包埋完整和临床资料齐全的女性乳腺癌患者。其中经手术、化放疗、内分泌治疗或靶向治疗后2年内复发的患者150例，同期2年内未出现复发的患者162例。所有病例均有完整的临床病理学资料和随访资料。

1.1.1 纳入标准

①经病理学检查确诊为乳腺癌；② 根治术后辅助治疗为TA C 或TA 方案：紫杉醇135 mg/m2或多西他赛75 mg/m2，静脉滴注，第1天；吡柔比星40 mg/m2，静脉滴注，第1天；环磷酰胺（C）500 mg/m2，静脉滴注，第1天。每21 d为1个周期，共6个周期；③接受规范的手术、化放疗、内分泌或靶向治疗。

1.1.2 排除标准

①非新疆长期居住人群（在疆居住时间＜15年）的患者；② 无法追溯其根治术时乳腺手术组织标本的患者。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 主要试剂

石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，琼脂糖、DNA Marker DL2000均购自北京全式金生物技术有限公司，核酸染料购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.2 主要仪器

台式离心机购自上海安亭科学仪器厂，漩涡混合器购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司，干式恒温器购自杭州美盛化工有限公司；核酸蛋白定量仪购自杭州奥康集团有限公司，电泳仪电源、电泳槽购自北京六一生物科技有限公司，凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank中人ABCG2基因rs2231142、rs2231137、rs2032582和rs1045642位点采用Primer 5.0软件设计，引物序列、长度及退火温度见表1。所有引物自行设计后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 实验方法

用石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒提取蜡块中DNA，在全自动分光光度计中检测提取出的DNA纯度和浓度。取2 μL DNA加入配置好的反应液中进行PCR扩增（反应体系见表2），扩增产物上样于3%琼脂糖凝胶孔中，120 V恒压电泳30 min，电泳完毕后使用凝胶成像仪观察，条带位置正确的样本送测序公司测序。

表1 位点引物序列Tab.1 Sequences of site primers

表2 PCR反应体系（25 μL）Tab.2 PCR reaction system (25 μL)

1.5 统计学处理

有复发组和无复发组在关联分析前分别进行Hardy-Weinberg检验。应用SPSS 19.0统计软件对所得数据进行分析。采用χ2检验比较基因型和等位基因频率，并计算出95% CI。采用t检验、方差分析和非参数检验对不同基因型的临床参数进行比较。多因素分析采用二维logistic回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者各因素比较分析

比较两组2年临床病理学资料和随访资料，结果表明，年龄、淋巴结转移个数、雌激素受体（estrogen receptor，ER）（+）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）（+）、组织学分级这5个因素在无复发组和复发组间差异有统计学意义（P＜0.05，表3）。

表3 2年内有复发组和无复发组患者一般资料比较Tab.3 Comparison of general data of patients with relapse group and relapse-free group within 2 years

2.2 PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳

对ABCG2基因的rs2231142、rs2231137、rs2032582和rs1045642位点进行PCR扩增，结果表明，扩增片段与预期一致，电泳条带单一清晰（图1）。

2.3 Hardy-Weinberg检验

表4为rs2231142、rs2231137、rs2032582和rs1045642位点的Hardy-Weinberg平衡检验，其中rs1045642、rs2032582、rs2231142位点在无复发组和有复发组中表达差异无统计学意义（P＞0.05），可能是由于该研究中所有样本均来源于患者，而非正常人群。

2.4 不同等位基因位点在不同组中分布差异及优势比估计

通过比较复发组和无复发组ABCG2基因4个SNP位点基因型分布及等位基因频率，发现rs2032582位点在新疆地区乳腺癌患者2年内无复发组及有复发组之间差异有统计学意义（P＜0.05，表5）。

图1 ABCG2基因4个SNP位点PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of the four SNP loci of the ABCG2 gene

表4 4个SNP位点基因型分布Hardy-Weinberg平衡检验Tab.4 Hardy-Weinberg equilibrium test for genotypic distribution of 4 SNP loci

表5 SNP位点不同等位基因在复发组和无复发组中的分布Tab.5 The distribution of different alleles of the SNP locus in the relapse group and relapse-free group

2.5 两组患者一般资料及SNP位点多因素比较

在单因素分析的基础上，将基因型和单因素分析P＜0.1的因素：年龄、肿块大小、PR（+）、组织学分级、rs2032582 GG型（+）与2年复发的关系采用采用多因素logistic逐步回归进行分析。在对其他因素进行调整后，年龄没有纳入模型，故年龄被视作影响乳腺癌2年复发的混杂因素。而肿块大小、ER（+）、PR（+）、组织学分级和rs2032582 GG型进入模型。分析结果显示，肿块大小、ER（+）、组织学分级和rs2032582 GG型可能为新疆地区乳腺癌患者复发的危险因素，而PR（+）则为保护因素（表6）。

表6 影响乳腺癌患者2年内复发的logistic多因素分析Tab.6 Logistic multivariate analysis affecting breast cancer patients’ recurrence within 2 years

2.6 COX回归模型分析临床多指标对判断预后的意义

对单因素分析中差异显著的肿块大小、ER（+）、组织学分级、rs2032582 GG型（+）进行多因素分析，结果显示，组织学分级和rs2032582 GG型对患者的预后有统计学价值，可能是影响乳腺癌复发的独立预后因素（表7）。

2.7 2年有复发组ABCG2基因rs2032582位点基因型与乳腺癌复发的相关性分析

2年有乳腺癌有复发组ABCG2基因rs2032582位点基因型与临床资料的相关性分析见表8。结果表明，G/T等位基因组的年龄极显著高于A等位基因组（P＜0.01），而A等位基因组的肿块大小、淋巴结转移个数和ER（+）显著高于G/T等位基因组（P＜0.05）。

表7 COX回归模型分析结果Tab.7 Analysis of COX regression model

表8 ABCG2基因rs2032582位点基因型与有复发组临床资料相关性分析Tab.8 Correlation analysis between the genotype of the ABCG2 gene rs2032582 and the clinical data of the relapse group

3 讨 论

在化疗前进行耐药基因的测定，按个体化选择用药，对提高临床疗效具有十分重要的意义［9-10］。与肿瘤细胞的多药耐药性相关的蛋白主要有P-糖蛋白、BCRP和ABCG2［11］，均属于ATP结合盒转运蛋白超家族，它们是异种生物转运蛋白，通过细胞外膜和细胞内膜运输各种分子，在多药耐药中发挥作用［12］。其中，BCRP可能是一种细胞防御机制，以应对米托蒽醌和蒽环类药物的暴露［13］。BCRP由ABCG2基因编码，ABCG2位于染色体4q22.1，共有21个外显子，已发现该基因的多个转录变体编码不同亚型［14-15］。

本研究以新疆地区2年内复发的乳腺癌患者150例和同期2年内未出现复发的乳腺癌患者162例为研究对象，采用简便、准确、快速的PCR技术进行基因分型，结合测序的方法检测ABCG2基因rs2231142、rs1045642、rs2231137和rs2231142位点基因多态性。结果显示，仅rs2032582位点在乳腺癌2年无复发组和有复发组之间存在差异，rs1045642、rs2231137和rs2231142位点在无复发组和有复发组中表达差异无统计学意义。同时G等位携带者发病风险与正常A等位基因携带者相比提高了3.29倍。这些均提示rs2032582与新疆人群2年内乳腺癌复发具有相关性。Wang等［16］采用流式细胞术、实时荧光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）、蛋白质印迹法（Western blot）检测了多发性骨髓瘤细胞系及临床样本中ABCG2的表达，并对PI3K/AKT信号通路加入抑制剂或激活剂后检测ABCG2的表达变化，发现PI3K/AKT信号通路可能通过一个潜在的负反馈调节机制调控ABCG2的表达，而ABCG2也可能通过负反馈调节机制调控同源性磷酸酶-张力蛋白的表达，即PI3K/AKT信号通路调控多发性骨髓瘤中ABCG2的表达，从而对化疗产生耐药性。Wang等［17］构建食管癌小鼠模型，分为高剂量青蒿素组、低剂量青蒿素组、多柔比星组、多柔比星+高剂量青蒿素组、多柔比星+低剂量青蒿素组、0.9%NaCl溶液对照组，采用流式细胞术检测7组中ABCG2蛋白表达和多柔比星浓度，发现ABCG2的mRNA和蛋白含量明显高于普通食管癌组，在多柔比星+高剂量青蒿素组和多柔比星+低剂量青蒿素组中，肿瘤细胞的凋亡率和多柔比星浓度明显下降，ABCG2蛋白的蛋白含量也明显下降，提示青蒿素可调节ABCG2在食管癌中的表达，从而逆转药物耐药。既往的研究已表明ABCG2参与到肿瘤细胞产生耐药的过程，如何进一步明确耐药点及逆转耐药显得十分必要。

以往的文献中，曾爱华等［18］用RTFQ-PCR检测了MDR1、MRP、LRP、GST-π、TOPOⅡa和BCRP基因在术前未化疗过的乳腺癌组织中的表达水平，发现这6个耐药基因在乳腺癌组织中的表达水平与临床分期、ER、PR无关，其中只有BCRP在淋巴结转移组织中的表达水平显著高于其在非淋巴结转移组中的表达。本研究生化指标分析结果显示，2年乳腺癌复发与无复发患者的肿块大小、ER（+）、PR（+）和组织学分级差异显著（P＜0.05）。分析ABCG2基因rs2032582位点A等位基因组和G/T等位基因组的临床生化指标，G/T等位基因组的年龄显著高于A等位基因组（P＜0.01），而A等位基因组的肿块大小、淋巴结转移个数和ER（+）显著高于G/T等位基因组（P＜0.05），该结果进一步验证了rs2032582基因型与乳腺癌复发相关的生化指标可能存在相关性。迄今为止，已发现有多个耐药基因与乳腺癌的发生和转移有相关性。Abuhaliema等［19］检测了约旦150例乳腺癌患者和150例正常对照组中MDR1的3个等位基因位点：C3435T（rs1045642）、G2677A/T（rs2032582）和C1236T（rs1128503），结果表明，携带C3435T（rs1045642）、G2677A/T（rs2032582）位点的人群可能增加乳腺癌的患病风险。Wang等［20］的一项共纳入了34个病例对照研究的Meta分析发现，MDR1的C3435T（rs1045642）位点与肿瘤的易感性相关，携带该位点的人群可增加患乳腺癌和肾癌的风险。Vulsteke等［21］对991例接受FEC序贯T方案的早期乳腺癌患者随访，平均随访时间为5.2年，结果表明，rs203258的GT型比GG/GA型有更长的乳腺癌特异性生存期（breast cancer-specific survival，BCSS）。Argalácsová等［22］对71例绝经前ER（+）的乳腺癌患者随访了56个月，该类患者均接受他莫昔芬内分泌治疗，并对该类人群进行基因检测，随访结果显示，携带rs1045642基因位点的患者生存时间明显延长，而携带rs2032582基因位点的患者并未显示出有更好的治疗效果或生存时间的延长。Kuo等［23］对414例激素受体阳性的早期乳腺癌患者进行ESR1、UGT1A1等6个基因的多态性检测发现，携带rs2231137（T/C）位点的乳腺癌患者有较差的无远处转移生存期（distant disease-free survival，DDFS）、无病生存期（disease-free survival，DFS）和总生存期（overall survival，OS），携带rs2231142位点的绝经前乳腺癌患者有较好的DDFS和DFS，但携带rs2231142位点的绝经后女性却无明显联系。本研究只检测出rs2032582位点差异有统计学意义，其余3个位点差异均无统计学意义，可能原因为新疆地域差异或是样本量小所致。

结合既往研究结果，rs2032582位点可能为乳腺癌发病的危险因素及预后不良的因素之一，与本研究的结果相一致，且本研究中复发组GG型明显高于其他突变类型，故新疆地区乳腺癌患者中携带rs2032582位点的GG型突变2年后复发率较高。但对携带rs2032582位点的乳腺癌患者如何进行干预及改善预后，尚待进一步研究。