microRNA-25在结肠癌中的表达及临床意义

殷小莉

结肠癌是消化系统常见的肿瘤，发病率以及病死率目前仍居高不下[1]。在发达国家，结肠癌在导致死亡的癌症疾病中排第二位[2,3]。在我国，结肠癌的发病率也呈上升趋势，且病死率亦明显增加[4]。主要与高脂肪饮食和纤维素摄入不足有关[5]。其中，慢性结肠炎与结肠息肉患者的发病率明显高于一般人群[6]。如果患者同时拥有家族性多发性息肉瘤，其癌变的发生率更高，可见遗传因素在结肠癌的发生过程中起到十分重要的作用[7]。目前对结肠癌的筛查指标主要包括血清癌胚抗原CEA和糖蛋白CA19-9[8]。但是研究指出二者的敏感性较低[9]。作为诊断结肠癌的金标准的结肠镜检查，是一种有创检查，患者接受度有待进一步提高[10]。如果能早期发现并明确诊断结肠癌，患者一般可以获得良好的预后[11]。研究表明miRNA的表达调控异常将导致恶性肿瘤的发生[12]。microRNA-25在多种恶性实体肿瘤中表达上调，但是最新研究表明，microRNA-25既能作为癌基因又能作为肿瘤抑制基因，其功能十分复杂[13]。目前仅有少数研究通过体外细胞实验探讨microRNA-25 在结肠癌中的作用，但microRNA-25能否可以作为预测结肠癌发展变化的诊断指标尚不可知。本研究拟比较结肠癌患者与健康人血浆中microRNA-25的差异表达，并比较在淋巴结转移、临床分期及发生部位的不同，探讨microRNA-25的临床诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 经石家庄市第三医院伦理委员会批准，收集2012年2月至2016年1月我院收治的50例结肠癌患者的血浆标本作为试验组，其中男28例，女22例；年龄(59.32±11.09)岁。所有结肠癌患者经消化内镜组织病理活检确诊且未经手术切除及放化学等治疗，无其他系统疾病及肿瘤。另外选取50例与其年龄、性别及种族相匹配的健康体检者的血浆作为健康组，其中男39例，女11例；年龄(58.12±10.49)岁；血浆标本获取均征求了患者以及家属的知情同意并签署知情同意书。记录2组患者的年龄、性别、TNM分期、有无淋巴结转移、血清CEA水平以及结肠癌发生位置。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及仪器:Trizol Reagent BD(美国ThermoFisher公司)；RT反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒(陆恒生物有限公司)；microRNA-25以及内参U6引物由北京博奥森公司设计并合成； Nano-Drop2000C紫外分光光度计(美国赛默飞世尔公司)； 7500Fast qRT-PCR仪(美国罗氏公司)。

1.2.2 血浆中总RNA的提取:根据Trizol说明书提取血浆中的总RNA，过程如下参考[14]：将 1 ml的Trizol 于200 μl血浆震荡混匀后静置5 min，加入200 μl 氯仿，剧烈振荡15 s；静置5 min，4℃12 000×g离心15 min，吸取上层无色液相500 μl，加入500 μl异丙醇，颠倒混匀，静置15 min，4℃12 000×g离心15 min，弃上清，加入75%乙醇1 ml混匀，4℃ 7 500×g离心5 min，弃上清自然干燥5 min,加入10 μl无RNA酶水溶解。冰盒运输，采用Nano-Drop2000C紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，并选取光密度D260/D280 在1.4～1.8者作为下一步实验对象。

1.2.3 反转录及qRT-PCR:反转录及qRT-PCR均按照说明书进行操作，具体如下：将提取的总RNA在42℃水中孵育20 min，然后在85℃孵育10 s。反转录条件如下： 95℃ 30 s ； 95℃ 5 s； 60℃30 s；共计40个循环。最后用7500Fast SystemSDS软件计算出Ct值，结肠癌组和健康组的microRNA-25相对表达量以2-ΔΔCt计算。ΔΔCt=(Ct目的基因- Ct管家基因)试验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组。

2 结果

2.1 2组外周血浆microRNA-25表达量比较 结肠癌组中与健康组中microRNA-25的相对表达量分别为(4.16±0.74)、(1.04±0.38)；2组差异有统计学意义(t=7.228,P=0.001)。见图1。

图1 结肠癌患者与健康组microRNA-25表达差异 (*P<0.05,与健康组比较)

2.2 结肠癌患者血浆中的microRNA-25在不同临床病理资料间的差异性 血浆中的microRNA-25在不同临床病理分级(TNM分期)间的表达差异：TMN分级越高血浆中microRNA-25的含量越低；差异有统计学意义(F=5.220,P=0.025)。两两比较发现：TNM Ⅲ期的microRNA-25的相对表达量明显高于Ⅰ期的患者，差异有统计学意义(t=1.068,P=0.011)。见表1。

TNM分期microRNA-25的相对表达量F(t)值P值Ⅰ(n=6) 3.54±0.315.2200.025Ⅱ(n=14)3.86±0.47Ⅲ(n=15)4.22±0.44Ⅳ(n=15)5.10±0.38

2.3 血浆中microRNA-25的表达与淋巴结是否转移的关系 淋巴结转移阳性结肠癌患者microRNA-25表达明显高于淋巴结转移阴性结肠癌患者，差异具有统计学意义(t=4.402,P=0.032)。男性患者血浆中的microRNA-25表达量为(2.85±0.39)，女性患者血浆中的microRNA-25表达量(2.91±0.53)，2组比较差异无统计学意义(t=1.021,P=0.339)。根据55岁为年龄界限，其中<55岁与≥55岁结肠癌患者microRNA-25表达量差异无统计学意义(t=0.382,P=0.108)。microRNA-25与血清CEA以及结肠癌的位置并无明显相关性。见表2。

项目microRNA-25的相对表达量F(t)值P值性别 男(n=30)2.85±0.391.0210.339 女(n=20)2.91±0.53年龄(岁) ≥55(n=34)4.35±0.410.3820.108 ≤55(n=16)4.51±0.48淋巴结转移 阴(n=27)4.26±0.314.4020.032 阳(n=23)5.44±0.32血清CEA(μg/L) ≤3.4(n=36)4.35±0.187.5310.104 >3.4(n=14)3.87±0.25结肠癌位置 左半结肠(n=26)4.08±0.325.1030.299 右半结肠(n=24)4.11±0.25

2.4 microRNA-25作为生物标志物的灵敏性和特异性 microRNA-25作为结肠癌的生物标志物(AUC)曲线下的面积为0.906，诊断价值最高。以2.06为相对表达量的节点，特异度为66.7%和灵敏度为96.2%，尤登指数为0.85。见图2。

图2 microRNA-25作为诊断结肠癌的ROC曲线

3 讨论

结肠癌的发病率处于恶性肿瘤的第三位，近些年来逐渐呈上升趋势。由于早期症状不明显，确诊时通常已属于中晚期，即使手术效果仍不理想[16]。晚期结肠癌5年生存率仅为25%，而早期的5年生存率约为90%[17,18]，因此，早期诊断筛查显得尤为重要。临床上应用结肠镜组织活检作为结肠癌筛选的首选方法[19]。但有研究指出此方法会造成肿瘤扩散且属于有创检查[20]。因此探讨肿瘤的新标志物对早期发现诊断结肠癌并增加结肠癌患者的生存率至关重要[21]。

microRNA是真核生物中一类长度约22个核苷酸的参与基因转录水平调控的非编码RNA[22]。miRNA具有调节细胞分裂周期，细胞分化、迁移等功能，参与疾病的发生发展[23]。miR25属于miR106B-25家族簇。该家族簇包括三个成熟的miRNAs(miR106b，miR-93-和miR-25)。他们在不同类型的肿瘤中均有表达，包括胃癌、前列腺癌、肝癌和胰腺神经内分泌肿瘤。miR-106b和miR-93具有相同的种子序列。相反，miR-25与它们没有相同的序列，预期具有单独的细胞功能。但是在结肠癌中的研究并不多见。Petrocca等[24]报道miR-106b和miR-93抑制细胞周期抑制因子CDKN1A的表达，而miR-25 降低BCL2L11的表达。这说明miR-106b和miR-93和miR-25的作用机制明显不同。

本研究发现结肠癌患者血浆中microRNA-25的表达明显升高，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。徐晓慧等[25]通过检测结肠癌组织与癌旁组织中microRNA-25的表达差异，得出microRNA-25在直肠癌及腺瘤组织中表达增高，在淋巴结转移和临床(TNM)分期差的病例中表达升高。但是组织中存在取材困难以及有创等缺点。因此本研究进一步证实microRNA-25作为促癌基因在结肠癌的发生发展中起到重要作用。同时本研究应用ROC曲线的绘制发现，microRNA-25作为结肠癌的生物标志物(AUC)曲线下的面积为0.906，其诊断的准确性为96.2%。曲线下的面积>0.9，说明其诊断准确性极高。

血清CEA是一种肿瘤细胞的黏附因子，动态监测CEA是临床上常用的监测肿瘤的复发、转移等指标有重要的临床意义[26,27]。本研究中microRNA-25在血清CEA高表达与低表达之间差异并无统计学意义(P>0.05)。但是这并不能直接反应microRNA-25与结肠癌的侵袭无关，因进一步动态监测加上长期随访确定microRNA-25与肿瘤预后的关系。

近些年来发现microRNA在肿瘤的发生发展，侵袭以及远处转移发挥了重要作用。本研究结果显示microRNA-25与结肠癌的肿瘤分期有关，随着结肠癌肿瘤分期的增加，microRNA-25的表达量增加，进一步说明microRNA-25可以促进结肠癌的发生发展。人体不同组织和肿瘤细胞的miRNA表达谱在数量和丰度上具有特异的区别，细胞产生的miRNA会随着血液的全身运行而循环至外周血中，使外周血中的miRNA也出现相应的区别。这是miRNA作为肿瘤诊断标志物的基础。Petrocca等[28]系统综述得出microRNA-25在胃癌、前列腺癌以及食管癌中均为高表达，并且可能通过下游不同的机制调控肿瘤的发生发展。Xu等[29]发现microRNA-25在食管鳞状细胞癌中高表达，并且microRNA-25的高表达与淋巴结的转移以及TNM分期有明显相关性，作者进一步分析发现micro-RNA-25可能通过靶向CDH1促进食管鳞癌的发生发展。单独应用miRNA的诊断敏感性提高的同时需要进一步提高诊断的特异性。这也是未来研究结肠癌标志物。

综上所述，结肠癌的发生发展是一个复杂的过程，结肠癌外周血中microRNA-25的高表达可能参与了其发生发展过程，为结肠癌的早期筛查提供了新指标。