紫外消毒动力学模型及影响因素

冯海宁，许冬雨，董怡琳，张 琳，王鹏飞，任芝军,*

(1. 河北工业大学能源与环境工程学院，天津 300401; 2. 惠州市东江环保股份有限公司，广东惠州 516000)

紫外线辐射是有效灭活微生物的方法之一[1-2]，灭菌过程几乎不受水体酸碱性和水温等水体环境因素的影响，具有操作简单、灭菌效果好且稳定的特点[3]。动力学模型可用来评价紫外灭菌效果[4]。杨辉等[5]运用Card公式建立了针对污水处理紫外光消毒效能的数学模型，研究表明，模型参数因水体质量、水层厚度、细菌类别变化而有所不同。徐秀娟等[6]深入研究了紫外线与过氧化氢联合使用去除污水中抗生素的效果及其反应动力学，结果显示，UV/H2O2降解抗生素完全符合准一级动力学，且水体质量对降解过程有不可忽视的影响，碱性条件下更利于降解。Kashimada等[8]通过建立模型，研究了细菌的紫外消毒中光辐照强度、辐照剂量、光吸收率等对光活化特性的影响，结果显示，动力学参数Sm(最大存活率)和ks(速率常数)与UV-C剂量有关，且光活化特性因细菌种类的不同而不同。 Vélez-Colmenares[7]对Kashimada等[8]提出的模型进行修改，增加了一个一级衰变项，使之能够适应紫外线照射后的细菌在阳光下所检测到的下降生存阶段，研究结果表明，新衰变常数Ms与Kashimada等[8]所定的UV-C剂量无关而取决于紫外太阳辐射。上述研究结果表明，紫外消毒动力学模型的建立与紫外剂量、微生物自身特征密切相关，选取合适的动力学模型，确定与模型参数关系密切的影响因素是当前利用模型精确模拟紫外消毒效果的关键。

本文采用静态紫外辐照装置，探讨了Chick-Waton模型、Collins-Selleck模型、Hom模型和Biphasic模型对紫外灭菌适应性及微生物的生长阶段对消毒动力学的影响。通过建立数学模型，解析紫外辐照时间和辐射强度对杀菌效果的共同作用关系，以期对紫外线高效灭菌提供更多的理论依据。

1 试验部分

1.1 试验材料与方法

1.1.1 试验菌种培养

试验所用大肠杆菌购自美国模式培养物集存库(ATCC)，编号：ATCC25922。

在温度为37 ℃恒温条件下，将菌种接种于LB培养基中，每隔一段时间检测其OD值[9]。

1.1.2 试验装置

试验采用自制的平行紫外线反应装置。该装置通过反射能够发出平行光束，减少光能的损失的同时增加了辐射能量，装置结构如图1所示。

图1 平行紫外光发生装置Fig.1 Parallel Ultraviolet Light Generator

装置主要由圆筒状外罩、紫外灯管、导光板、透镜组成。紫外灯管通过灯管夹置于桶状外罩内，外罩内下部放有倒锥形导光板，锥尖为直径为5 cm的小孔，孔内装有石英玻璃材质的凸透镜，紫外透过率高。装置下部为暗室，用以消除室外光线带来的试验误差。暗室设有滑动拉门，内部放置试验用磁力搅拌器。紫外灯管发出来的光通过导光板的折射聚集在孔口，小孔的面积远小于装置总体面积，可看做点光源。调节孔下透镜位置，使其位于折射光源焦点处，通过透镜射入暗室的光即为平行光。采用TES1335紫外辐照计测量反应室内紫外强度，通过调节灯管伸入反射室的长度来控制试验条件下紫外辐照强度。经试验拟合，灯管伸入反射室长度与试样所受紫外辐照强度线性关系良好，紫外光束稳定，紫外强度可达600 mW/cm2。

1.1.3 主要试验仪器

试验仪器：TGL16-A台式高速离心机(北京华瑞科学器材)，ZNCL-GS水浴锅(天津科诺仪器设备有限公司)，UV-B15瓦低压紫外灯管(锦州市光学医疗器械厂)，XSZ-G光学显微镜(重庆光电仪器有限公司)，TES1335紫外辐照计(台湾泰仕紫外照度计)，752 N紫外分光光度计(上海精科仪器有限公司)，DHG-9 053 A数显生化培养箱(无锡马瑞特有限公司)。

1.1.4 主要试验药剂

试验药剂：硝酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，天津市天力化学试剂厂；β-D乳糖、氯化氢，九鼎化学；乳糖葡萄糖苷酸琼脂，英国Oxoid；酚氯仿、氯仿、异戊醇、EB溴化乙锭、琼脂糖，天津凯马特化工科技有限公司；异丙醇、氢氧化钠，福晨化学试剂有限公司。

1.2 消毒动力学试验

1.2.1 Chick-Watson模型

Chick-Watson线性模型是假设消毒剂分子的浓度与待灭活的微生物的数量之间存在化学计量关系前提下对Chick模型的修正[10-11]。通过观察病毒灭活与试验时间的函数关系来评估灭活动力学，Chick-Watson模型如式(1)。

lg(N0/Nt)=kDt

(1)

其中：k——灭活速率常数；

N0——反应时间为0时微生物的浓度，CFU/mL；

Nt——反应时间为t时微生物浓度，CFU/mL。

Dt——试样所受紫外照射剂量，mJ/cm2。

1.2.2 Collins-Selleck模型

Colins-Selleck模型对滞后和拖尾现象均有体现[12]，Collins-Selleck模型如式(2)。

lg(N0/Nt)=-lgτ+nlgDt

(2)

其中：τ——方程系数；

n——方程系数。

1.2.3 Hom模型

Hom[13]对Chick-Watson拟一级速率定律进行了经验推广，得到经验Hom模型。Hom数学模型既适用于模拟与一级动力学规律一致的灭活曲线，又能拟合与一级动力学规律有偏差的灭活曲线。Hom模型如式(3)。

lg[ln(N0/Nt)]=lgK+nlgDt

(3)

其中：K——模型致死系数。

1.2.4 Biphasic模型

Biphasic模型可以分为两部分，其中一部分表示消毒曲线的一阶线性，另一部分表示消毒曲线的拖尾现象[13]，模型如式(4)。

lg(N0/Nt)=lg[(1-x)·e(-k1·Dt)+x·e(-k2·Dt)]

(4)

其中：x——微生物对紫外灭活的抗性；

k1——微生物对紫外灭活的敏感性；

k2——微生物初始浓度对紫外灭活的敏感性。

2 结果与讨论

2.1 紫外灭菌动力学模型的模拟

在大肠杆菌稳定期(t=14 h)时，采用平行紫外光发生装置进行灭菌研究，采用决定性系数R2和均方根误差RMSE两种评估指标对4种模型的模拟结果与观测数据进行对比分析(表1)。其中，R2用于表征模拟值和实际值之间的相关性，RMSE用于衡量模拟值和实际值之间的误差[14]。通常，R2越接近于1，拟合精度越高。有关研究表示，当数据被转换为log10等级时，RMSE小于0.5被认为是较为精确的模型[15]。

表1 稳定期大肠杆菌动力学模型(t=14 h)Tab.1 Kinetics Models for E. coli in Stationary Phase (t=14 h)

稳定期大肠杆菌的4种动力学模拟结果如图2所示。

由图2(a)可知，Chick-Watson模型的拟合结果中，只有在紫外强度为272 mJ/cm2时，离散点位于拟合曲线周围，其他离散点严重偏离其拟合曲线。发生明显的非线性偏离的原因可能与装置的构造、试验过程和大肠杆菌自身抗性有关。当紫外灭菌过程偏离一级动力学的灭活曲线时，Chick-Watson模型不能拟合出反应曲线，显然不能用于本研究动力学拟合[16-17]。

图2(b)拟合的Collins-Selleck模型方程中R2为0.961 1，RMSE为0.535 2，均优于Chick-Watson模型值。说明Collins-Selleck模型与Chick-Watson模型相比，考虑到了灭活曲线的非线性规律，其拟合效果有所改善。但是Collins-Selleck模型只能模拟有迟滞现象的曲线，考虑本试验中出现的拖尾现象，采用Hom模型进行修正[18]。

Hom模型中常数n与1的大小决定其表现迟滞或拖尾现象。虽然图2(c)中Hom模型n值为0.602 4，小于1，可用Hom模型拟合有拖尾现象的曲线，但Hom模型方程的RMSE为0.066 3，根据lg[ln(N0/Nt)]计算RMSE小于0.061 2时才能精确拟合。同时，研究表明，Hom模型拟合参数的离散程度大。因此，Hom模型并不能精确拟合曲线。

4种模型方程计算结果相比，Biphasic模型的R2最高为0.995 0。同时，两阶模型拟合的RMSE为0.231 2，小于0.5。表明Biphasic模型是4个模型中最符合本试验条件下的紫外灭活大肠杆菌的动力学模型。模型能够更直观地解释试验因素(例如生物量密度、紫外线灯管数等)对紫外消毒性能的影响[19-20]。Biphasic模型不仅能精准拟合灭活曲线，而且也适用于描述有拖尾现象的曲线，所以越来越多的研究者用其进行消毒曲线的拟合，综上所述，选取Biphasic模型作为深入研究紫外灭活大肠杆菌的动力学模型[21-22]。

图2 紫外灭活大肠杆菌拟合曲线 (a) Chick- Watson 模型； (b) Collins-Selleck模型； (c) Hom模型； (d) Biphasic模型Fig.2 Fit Curve of UV-Inactivated E. coli (a) Chick- Watson Model； (b) Collins-Selleck Model； (c) Hom Model； (d) Biphasic Model

2.2 大肠杆菌不同生长期对其灭活率的影响作用

大肠杆菌生长期共分为3个阶段，即适应期、对数期和稳定期，采用Biphasic模型对大肠杆菌3个生长期的灭活曲线进行拟合，如图3所示。

图3 不同生长期大肠杆菌灭活曲线Fig.3 Inactivation Curve of E.coli in Different Growth Stages

图3中，Biphasic模型拟合的3个不同生长期大肠杆菌灭活曲线均出现拖尾现象，而造成拖尾现象的原因可能是细胞内含有能修复自身损伤的酶，这种酶能使细胞进行暗修复，使其继续增殖[23]。不同时期的大肠杆菌紫外灭活曲线到达拖尾阶段的临界紫外剂量不同，对数期、适应期和稳定期的灭菌临界紫外剂量分别为50、200、160 mJ/cm2，对数期的临界值最小。可见，当微生物处于生长对数期时对紫外辐照最为敏感，细菌的生长状态对于紫外杀菌效果有重要影响。微生物在对数生长期的生长速率能达到最大值，细胞数目稳速递增，细胞形态及其生理变化保持一致，代谢周期短[24]。这就是对数生长期微生物对紫外灭活最为敏感的原因。

在Biphasic模型中，对数期细菌的k1值大于其他2个时期值，同时x值低于适应期值且与稳定期值相似，说明紫外辐射对处于生长初期的微生物影响最大。图3中，大肠杆菌各时期k1值按大小顺序为：对数期(k1=0.555 3)>稳定期(k1=0.117 9)>适应期(k1=0.072 7)；x值按大小顺序为：迟滞期(x=7.0×10-6)>稳定期(x=1.2×10-7)≈对数期(x=2.8×10-7)。这表明大肠杆菌在生长适应期对紫外辐射的抗性大于稳定期。细菌生长稳定期特点是新细胞的分裂增殖速度等于老细胞的衰亡速度，培养基内细菌的整体数量稳定，为适应外界条件变化，细菌暂时不进行分裂增殖的阶段为其生长的适应期[25]。由此可见，适应期的微生物比稳定期的微生物面对外界环境变化时呈现更高的稳定性。Matthew等[26]研究发现，在适应期生长阶段，微生物主要存储细胞分裂所需的养分和与合成有关的活性酶，这些活性酶可以修复微生物损害[27]。这也是本研究中，处于适应期的大肠杆菌对紫外的辐照与其他生长期相比有着更大抗性的原因。

2.3 响应面法探究紫外辐照时间和剂量的协同增效作用

紫外辐照时间和紫外辐照强度是紫外灭菌的重要因素[28]。采用响应面法与数学模型结合的试验方式，进一步探究紫外辐照强度和辐射时间的相互作用关系。结合响应曲面图(图4)与等高线分析图(图5)进行分析，安排了2因素5水平的中心组合试验。为了减小试验误差，本试验设计的中心点均进行5次相同试验。

图4 照射时间和辐照强度对杀灭大肠杆菌的影响3D立体图Fig.4 3D Perspective View of the Effect of Irradiation Time and Irradiation Intensity on E.coli Inactivation

图5 照射时间和辐照强度对杀灭大肠杆菌的影响平面等高线图Fig.5 Plane Contour Map of the Effect of Irradiation Time and Irradiation Intensity on E.coli Inactivation

通过Design Expert应用程序计算得出大肠杆菌对数灭活率和紫外辐照时间及强度的方程系数，并进行回归方差分析。结果表明，模型的F值为161.05，意味着方程显著；P值为0.028 7，而发生由噪声产生的大于模型F值的情况只有0.01%的可能，表明没有失拟现象。因而该模型拟合度良好，可用于紫外照射对大肠杆菌的灭活规律的理论预测。

由图4可知，在紫外照射时间为120 s，辐照强度为0.1 mW/cm2时，大肠杆菌的紫外对数灭活率值最小，为1.299。在120～480 s时，辐射时间越长，随着紫外强度的增加，大肠杆菌紫外对数灭活率的增长也越来越大。因此，照射时间和辐射强度对杀灭大肠杆菌有协同增效作用。图5中辐照时间方向的梯度明显大于辐照强度方向，说明照射时间对紫外灭菌过程的影响大于辐照强度。这一结论的实际意义是在紫外能耗相同时，通过降低辐照强度、增加辐照时长的办法来提高灭菌效率。王俊琳[29]在太阳能强化消毒技术的研究中也表明，紫外线剂量是灭菌效果的直接影响因素，可以通过增加照射时间弥补太阳光中紫外线强度低的特点。

3 结论

(1)与其他3种模型相比，两阶段模型拟合紫外灭活大肠杆菌过程的R2最高，为0.995 0，即相关性最好；RMSE为0.231 2小于0.5，模型值与实际值间的差距较小，最适用于作为本研究条件下的细菌紫外灭活曲线的动力学模型。

(2)大肠杆菌的生长期与紫外灭菌效果有一定的关系，紫外照射对处于对数期的大肠杆菌影响最大，适应期和稳定期的大肠杆菌对紫外的抗性均大于对数期，故紫外灭菌的最佳时期为对数期。

(3)紫外照射时间和辐照强度对杀灭大肠杆菌具有协同作用，且前者的影响要大于后者。紫外能耗相同的条件下，可通过延长紫外照射时间、降低辐射强度的方法提高灭活效率。