多管发酵法和酶底物法检测总大肠菌群的结果差异性

楼小平，林增飞

(宁波市自来水有限公司，浙江宁波 315000)

多管发酵法、酶底物法都是生活饮用水标准检验方法中规定的检测总大肠菌群的方法，其中多管发酵法为仲裁法。多管发酵法检测步骤多，耗时长，一次典型的检测需3 d；而酶底物法检测方便，耗时短，一般能在24 h出结果，对检测人员的专业技能要求低。因此，很多人倾向于选择后者，但在实际工作中普遍存在困扰：两种检测方法的检测结果经常表现出较大的差异。本文采用两种检测方法检测不同类型的样品，对检测结果进行了比较分析，并对造成结果差异的原因做了进一步研究和探讨。

1 试验方法与材料

1.1 试验方法

(1)多管发酵法：《生活饮用水标准检验方法》(GB 5750.12—2006)2.1节。

(2)酶底物法：《生活饮用水标准检验方法》(GB 5750.12—2006)2.3节中的51孔法。

(3)菌种鉴定：细菌16S rDNA基因测序鉴定方法，实验室分离纯化后送浙江天科高新技术发展有限公司鉴定。

(4)灵敏度测试：大肠埃希氏菌标准菌CICC 23657、阴沟肠杆菌标准菌 CICC 21539的新鲜培养物用无菌生理盐水稀释，然后吸取1 mL稀释样品分别接种到乳糖蛋白胨单倍培养基、MMO-MUG培养基试管中培养观察，同时，以平板计数方法对接种量进行定量。MMO-MUG培养基试管制备：取MMO-MUG培养基1支，用90 mL无菌生理盐水溶解混匀后分装成10支试管，每支9 mL。

1.2 仪器与试剂

营养琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司)、乳糖蛋白胨培养基(广东环凯微生物科技有限公司)、伊红美蓝琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司)、MMO-MUG培养基(IDEXX公司)、程控定量封口机、涡旋振荡器、大肠埃希氏菌标准菌CICC 23657(中国工业微生物菌种保藏中心)、阴沟肠杆菌标准菌CICC 21539(中国工业微生物菌种保藏中心)。

2 结果与讨论

2.1 两种方法检测生活饮用水样品

共检测72个样品，样品来源包括管网水、末梢水、二次供水，结果如表1所示。

表1 生活饮用水样品比对结果 Tab.1 Comparison Results of Drinking Water Samples

2.2 两种方法检测污染样品

污染样品检测结果如表2所示。

表2 污染样品比对结果 Tab.2 Comparison Results of Contaminated Water Samples

注：1～11号样品为水厂进口水源水；12～19号样品为城市内河水用生理盐水稀释100倍

2.3 两种方法检测大肠埃希氏菌加标样品

加标样品以大肠埃希氏菌标准菌CICC 23657新鲜培养物用无菌生理盐水稀释制备，结果如表3所示。

表3 大肠埃希氏菌加标样品比对结果Tab.3 Comparison Results of Escherichia coli Spiked Samples

2.4 灵敏度测试

灵敏度测试结果如表4所示。

表4 灵敏度测试比对结果Tab.4 Comparison Results of Sensitivity Tests

注：大肠埃希氏菌CICC 23657每种浓度平行接种5管；阴沟肠杆菌CICC 21539每种浓度平行接种3管；接种量由平板计数法进行定量(双平板读数)；“+”表示阳性，“-”表示阴性

2.5 讨论

2.5.1 不同类型样品的检测结果分析

对19份污染样品检测结果(表2)作对数处理后进行配对t检验，P<0.05，检测结果有显著性差异。对大肠埃希氏菌加标样品进行了两组比对(表3)，比对一组的结果对数处理后进行配对t检验，P>0.05，检测结果无显著性差异；比对二组进行了重复性测试，两种方法的结果均值分别为51 MPN/(100 mL)和49 MPN/(100 mL)，再次验证了两者结果的一致性。72份生活饮用水样品检测结果(表1)显示，两种检测方法结果均为阴性，无法比较两种检测方法的结果差异。两种方法检测不同类型样品，其结果的差异性表现有所不同，而方法的特异性、灵敏度是微生物检测影响结果的重要因素，以下为具体分析内容。

2.5.2 方法特异性

总大肠菌群一般是指一群能在35～37 ℃条件下24～48 h发酵乳糖产酸产气需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，主要包括埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属[1]。《生活饮用水卫生标准》(GB 5750.12—2006)中酶底物法对总大肠菌群的定义是指能在选择性培养基上产生β-半乳糖苷酶的细菌群组。微生物发酵乳糖主要依靠乳糖渗透酶、β-半乳糖苷酶的参与。β-半乳糖苷酶在动物组织、植物和微生物中广泛存在[2]。王维梅等[3]曾对β-半乳糖苷酶检测肠杆菌的特异性进行了研究，通过3次重复检测克雷伯氏菌，均得到了阴性结果。本实验室从两种方法结果差异较大的样品中分离出两株菌株，经重复测试，乳糖蛋白胨培养24～72 h，阴性(无明显产酸产气)；MMO-MUG培养24 h，阳性，经细菌16S rDNA基因测序鉴定为桑树肠杆菌Enterobactermori(R18-2)、路氏肠杆菌Enterobacterludwigii(EN-119)；乳糖蛋白胨对这两种肠杆菌未表现出特异性。由此可见，两种方法对总大肠菌群的定义有区别，两种方法检测的目标菌也存在一定的差异。总大肠菌群作为粪便污染指示菌，从来不是细菌分类学上的单一属种，酶底物法在国际上得到广泛应用。

表2中，水厂进口水源水大肠埃希氏菌含量明显比城市内河水稀释样低，污染程度相对较低，酶底物法与多管发酵法检测结果的比值相应地比后者高，最高甚至达到了400倍，而内河水稀释样最高只有6倍。王晋宇等[4]曾对长江水域地表水样品和太湖水域地表水样品进行比对，结果显示长江水域地表水样品检测结果无统计意义上的差异，而太湖水域地表水样品的检测结果有较大的区别(多管发酵法基本未检出)。因此，两种方法检测结果的差异大小可能与检测样品的污染程度有一定关联，不同污染程度样品的细菌种类组成不同。而表1中两种方法检测72份生活饮用水样品的结果均为阴性，其中5份样品的菌落总数达300～580 CFU/mL，这可能与生活饮用水样品经消毒处理后细菌种类组成相对简单有关。

2.5.3 方法灵敏度

灵敏度是指从众多菌中检测到目标菌的能力，参考《食品微生物检验方法确认技术规范》(SNT 3266—2012)。本试验只考察了两种方法培养基对大肠埃希氏菌CICC 23657、阴沟肠杆菌(CICC 21539)的检测表现。表4在相同的接种量下(接种量用平板计数法定量，表中结果为两个平板的读数)，乳糖蛋白胨和MMO-MUG培养基对大肠埃希氏菌的灵敏性未表现出差异，产生阳性结果的时间(培养时间为18 h以上)和阳性管数均较为一致。对于阴沟肠杆菌，在接种量为8～28 CFU时，乳糖蛋白胨在培养时间为18 h时就已经有明显的阳性结果。而MMO-MUG培养基在培养28 h后还没有阳性结果(培养时间为48 h时有明显的阳性结果)，对阴沟肠杆菌(CICC 21539)表现出较明显的迟滞效应，灵敏度弱于多管发酵法的乳糖蛋白胨。这与王晋宇等[4]的试验结果有明显的差异，他们发现阴沟肠杆菌(CICC 22927)接种量为200 MPN/100 mL以下时，多管发酵法具有明显的发酵延迟现象，这是否是由于试验所用的阴沟肠杆菌菌株不同需进一步验证。另外，杨毓环等[5]也曾检出乳糖发酵迟缓的产气肠杆菌。在实际样品检测中，灵敏度还可能会受到更多因素的影响，比如不同类细菌之间的竞争。

3 结论

(1)多管发酵法和酶底物法检测总大肠菌群结果差异的大小与样品的细菌种类组成有关，而多管发酵法和酶底物法检测原理的不同导致检测的目标菌有一定的差异，是两者结果差异的根本原因。

(2)酶底物法对肠杆菌属中的桑树肠杆菌、路氏肠杆菌有特异性，而多管发酵法未表现出特异性。酶底物法对阴沟肠杆菌(CICC 21539)的灵敏性不如多管发酵法，表现出较明显的迟滞效应。

(3)酶底物法在检测时效性、便捷性上具有不容忽视的优点，可作为生产企业检测控制手段，但如果用作产品合格检验或仲裁检测时应慎重，统一总大肠菌群定义是当前急需解决的问题。