Lifeport 灌注液中生物标志物与尸体供体肾移植术后移植肾功能延迟恢复的相关性分析

丁晨光，乔予希，李杨，田晓辉，田普训，丁小明，郑瑾，李潇，薛武军 （1. 西安交通大学第一附属医院肾脏病医院肾移植科，陕西 西安 710061；2.西安交通大学器官移植研究所，陕西 西安 710061）

影响肾移植预后的因素众多，供体肾脏的质量是影响预后的最重要因素。准确的供体肾脏质量评估是供体器官有效利用的核心，有利于在器官分配中最优化地利用供体器官，对于患者的个体化管理有着重要意义，有利于使得供体肾脏的恢复情况及远期肾功能达到最优［1-2］。压力控制模式的Lifeport 为供肾质量的评估提供了客观依据，多项研究发现终末灌注阻力是肾移植术后发生移植肾功能延迟恢复（delayed graft function， DGF）的独立危险因素［3-5］，然而，单一应用终末灌注阻力的预测能力较差，报道显示对DGF 的ROC 曲线下面积为0.58 ～0.61［1］。关于灌注液中生物学标志物评估供肾质量预测移植预后的报道尚存争议，传统生物学标志物的报道结论不一［6-10］，单独应用单一指标的诊断价值欠佳。但多项研究提示谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）、白细胞介素-18（interleukin-18，IL-18）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL）、N-乙酰-β-D 氨基 葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAG）可作为DGF 的预测指标［6-10］。研究发现这些灌注液生物学标志物与冷缺血时间及灌注阻力并不相关［8-9］。但关于灌注液中生物学标志物我国尚缺乏研究数据，因此，本研究旨在通过检测灌注液中GST、IL-18 和NAG 的浓度联合灌注参数预测尸体供体（dead donor，DD）肾移植术后DGF 的价值。

1 资料与方法

1.1 纳入和排除标准

1.1.1 供体纳入标准：① 符合国家DCD 器官捐献的供者；② 无药物滥用史，无如下高危活动，如静脉注射毒品史、同性恋／双性恋男性、血友病／凝血机制紊乱；③ 无恶性黑色素瘤、转移性恶性肿瘤，或不可治愈的恶性肿瘤，一些早期阶段的恶性肿瘤在经过成功的治疗后也可以考虑；④ 无活动性的、未经治疗的全身细菌、病毒或者真菌感染；⑤ 患者身份明确；⑥ 18 岁≤供者年龄≤70 岁；⑦ 艾滋病毒（human immunodeficiency virus，HIV）抗体阴性。

1.1.2 受体纳入标准：① 单脏器移植（肾移植）；② 首次进行肾移植；③ 未处于孕期或哺乳期，妊娠试验阴性，且在治疗期间承诺不怀孕；④ 患者理解并自愿于试验流程进行前签署知情同意书； ⑤ 身高体重指数（body mass index，BMI）＜26。

1.1.3 供体排除标准：① 年龄大于70 岁；② 血清乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或HIV 阳性。

1.1.4 受体排除标准：① 双器官或多器官移植；② ABO 血型不合；③ 二次及以上肾移植；④ 肾移植术后24 h 内移植肾失功；⑤ 无透析肾移植（preemptive kidney transplantation，PKT）；⑥ 参与其他研究。

1.2 疾病定义：DGF，本研究中需符合以下条件之一：① 肾移植术后1 周以内需要透析治疗； ② 肾移植术后10 d 后血肌酐高于400 μmol/L； ③ 肾移植术后2 周后血肌酐高于300 μmol/L。根据 以上标准，且最终移植肾功能可恢复，即诊断为DGF。移植物原发性无功能（primary non-function，PNF）：肾移植术后3 个月内，在无排斥反应或造成移植失败的外科因素的情况下，移植肾功能不足而需要透析。肾功能恢复时间：术后移植肾功能首次恢复到正常（血肌酐≤140 μmol/L）的时间。

1.3 临床和实验室资料：收集2019 年6 月1 日—2019 年9 月31 日期间西安交通大学第一附属医院应用Lifeport 进行灌注维护的43 例DD 肾脏移植供、受者的基本资料（表1）、终末期Lifeport 灌注参数、灌注4 h 的灌注液（-80℃保存备用）、手术及术后并发症情况等，收集肾移植受者术后3 个月内的实验室生化指标。43 例DD 肾移植受者根据是否发生DGF 分为DGF 组和NO-DGF 组，随访3 个月。

1.4 灌注液生物标志物的检测：标本的预处理，取出-80℃保存的灌注液标本，置于室温下解冻；使用台式高速低温离心机（10 000×g，10 min，4℃）离心，使灌注液中杂质完全悬于离心管底部；为避免反复冻融，取上清分装于1.5 ml EP 管，迅速放入-80℃储存备用。注意无菌操作。酶联免疫法测定IL-18，比色法测定NAG 和GST。

类别 参数供者年龄（岁，images/BZ_37_1351_1170_1373_1213.png±s）42.6±14.4 性别（%） 男性83.0 女性17.0 死亡原因（%） 颅脑创伤56.1 脑血管意外33.9 缺血缺氧性脑病4.7 其他5.3 BMI（kg/m2，images/BZ_37_1351_1170_1373_1213.png±s）21.9±3.3 高血压病史（%）24.9供肾热缺血时间（从心跳停止至冷灌注） （min，images/BZ_37_1351_1170_1373_1213.png±s）9.1±5.6冷缺血时间（min，images/BZ_37_1351_1170_1373_1213.png±s）372±174受者年龄（岁，images/BZ_37_1351_1170_1373_1213.png±s）36.4±10.1 HLA 错配数（个，images/BZ_37_1351_1170_1373_1213.png±s）1.96±1.08

1.5 受者免疫制剂方案：① 免疫诱导：给予兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白（rabbit anti-human thymocyte immunoglobulin，rATG）1.5 ～2.0 mg/（kg·d）+甲泼尼龙250 mg/d，静脉滴注，3 ～4 d；② 免疫抑制剂维持方案：术后当天起服用霉酚酸酯类：吗替麦考酚酯2.0 g/d，或麦考酚钠1.44 g/d，间隔12 h口服；术后2 d给予他克莫司0.06～0.08 mg/（kg·d），间隔12 h 口服；诱导治疗结束当天起，给予口服泼尼松10 mg/d 并维持。此后，根据血药浓度、血肌酐水平及体重调药。

1.6 伦理学：本项研究得到了西安交通大学第一附属医院伦理委员会的批准。研究符合《赫尔辛基宣言》提出的道德标准。所有捐献者均符合我国器官捐献标准，捐献者亲属签署器官捐献自愿书等相关文件后，待捐献者心跳停止3 ～5 min，判定捐献者心脏死亡后，采用经腹主动脉、门静脉联合灌注，多器官联合切取的标准术式获取捐献器官。

1.7 统计学分析：利用单因素和多因素分析方法研究供肾机械灌注参数和灌注液生物标志物对肾移植术后DGF 发生的影响。连续性变量用均数±标准差（±s）表示，并根据数据的结构特征利用Student t 检验或Mann-Whitney U 检验比较两组间变量的差异。单因素Logistic 回归分析得到未经校正的各Lifeport 参数对DGF 的比数比（OR 值）。对单因素分析有意义的变量进行多因素Logistic 回归分析，筛选发生DGF 的独立危险因素。利用COX 比例风险模型分析Lifeport 参数和灌注液标志物与移植肾功能恢复正常时间之间的相关性。通过绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线及计算曲线下面积评价危险因素预测DGF 的价值。两组移植肾功能恢复正常时间利用Kaplan-Meier 生存曲线显示，并做log-rank 检验。使用SPSS 22.0 进行数据分析。双侧α ＝0.05 作 为检验水准（P ＜0.05 认为差异具有统计学意义）。

2 结 果

2.1 肾移植术后DGF 和肾功能恢复情况：24 例供体，43 例DD 肾移植受者纳入研究，8 例受者发生DGF，DGF 发生率为18.6%（8/43），DGF 组8 例受者，NO-DGF 组35 例受者。肾功能恢复时间的均值为（11.7±10.6）d，其中DGF 组肾功能恢复时间为（30.8±22.7）d，NO-DGF 组（6.8±7.0）d，两 组移植肾功能恢复的Kaplan-Meier 生存曲线（图1） 经Log-Rank 检验差异有统计学意义（P ＜0.001）。

2.2 Lifeport 灌注参数与DGF 的相关性：Lifeport灌注参数的单因素Logistic 回归分析显示（表2），初始流量、终末阻力、终末流量是DGF 的危险因素，多因素Logistic 回归分析显示终末阻力是DGF 的独立危险因素 （OR ＝1.879，95% CI ＝1.145 ～3.56）。

2.3 Lifeport 灌注液标志物与DGF 的相关性：NAG、GST 在DGF 组平均浓度均较NO-DGF 组显著升高（P ＜0.05），IL-18 在DGF 组稍高于NODGF 组，但组间差异均无显著性（表3）。多因素Logistic 回归分析显示GST 是DGF 的独立危险因素（OR ＝1.62，95% CI ＝1.23 ～2.46）。

LifePort 参数P 值OR（95% CI）初始压力（10×mmHg）0.245 1.344（0.683-2.043）初始流量（10×ml/min）0.036 0.663（0.452-0.973）初始阻力〔10×mmHg/ （ml·min）〕0.055 1.874（0.932-3.021）终末压力（10×mmHg）0.080 1.221（0.876-1.553）终末流量（10×ml/min）0.021 0.625（0.419-0.932）终末阻力〔10×mmHg/ （ml·min）〕0.018 1.979（1.126-3.481）灌注时间（h）0.176 3.542（0.642-9.863）

分组NAG（U/L）GST（μg/ml）IL-18（pg/ml）DGF3.17±1.2113.04±6.5028.73±23.50 NO-DGF2.59±0.609.03±5.0318.00±15.01 P 值0.0260.0160.212

2.4 Lifeport 灌注液生物标志物增加灌注参数预测DGF 的效能：单独应用终末阻力预测DGF 的ROC 曲线（图2A）曲线下面积（area under curve，AUC）及95% CI 为0.756（0.693 ～0.818），单独 应 用GST 预 测DGF 的ROC 曲 线（图2B）AUC及95% CI 为0.729（0.591 ～0.806），联合二者预测DGF 的ROC 曲 线（图2C）AUC 及95% CI 为0.888（0.842 ～0.933）。比较GST 联合终末阻力预测DGF 的 AUC 与单独应用终末阻力预测DGF 的AUC，预测准确性相较于单独应用终末阻力显著提高（P ＝0.023）。

3 讨 论

Lifeport 对离体肾脏的保护机制尚不完全明确。它可能通过减慢ATP 的消耗速度，持续灌注保证了肾脏血管床的畅通，并能带走有害的代谢产物，上调KLF2 和抑制TGF-β 通路从而减轻供肾的炎症反应，减轻肾脏细胞的凋亡，以及提升内皮型一氧化氮合酶mRNA 表达，增加内源性血管舒张因子一氧化氮水平等多种机制对供肾发挥保护作 用［11-14］。Lifeport 同时提供了一个观察与干预的窗口，实时显示的机械灌注参数和可提取/加入的灌注液成为移植医师关注的新热点。

国际上报道的HMP 灌洗液中生物标志物（biomarker）多达10 余种。GST 被认为是最具前景的生物标志物之一［7，15］。GST 抗氧化酶构成胞内多功能的同工酶超家族，催化还原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）与多种毒性产物的结合反应，包括外源性化学物质和具有氧化活性的中间产物（如脂质和DNA 的过氧化物以及醛类），从而使它们毒性更小，并从细胞中移除。GST 在细胞内发挥关键的解毒作用，保护大分子免受活性氧自由基等的攻击。研究发现， 改变GST 的活性可以干扰细胞内的氧化还原状态［16］。低温机械灌注4 h 后，灌洗液内的GST 浓度不再增加［8］，提示GST 主要来自之前的缺血损伤和细胞破坏。这和另一研究较多的损伤标志物不同，NAGL 被发现在缺血损伤后出现mRNA 的逐渐上调。研究表明，αGST 仅限于近端肾小管，πGST 发现于远端肾小管和集合管。αGST 显示出与WIT 的强关联，这与近端肾小管更易遭受缺血损伤相符合。同时，另有前瞻性多中心研究发现低温机械灌注终末的αGST 浓度与DGF 相关，这也对以往认为远端肾小管损伤程度对DGF 发生与否影响最大提出了质疑［15］。部分研究者认为检测总GST 更具有可行性。IL-18 是缺血/再灌注损伤过程中由巨噬细胞和其他多种类型的细胞产生的前炎症因子，进而促进炎症反应；同时可以通过免疫或非免疫介导的多种机制造成组织损伤。多项研究表明IL-18 和DGF 相关［7］。一项前瞻性的多中心RCT 研究显示GST、NAG 是DGF 的独立危险因素。NAG 是一种存在于多种组织器官中的溶酶体酶，在尿路系统中主要存在于近曲小管上皮细胞内，有一定的特异性，它的释放与肾小管缺血损伤相关［8］。因而GST、NAG 和IL-18 反映了离体肾脏氧化应激、细胞损伤、炎症反应等不同层面，本文选择对Lifeport 灌洗液中的以上指标进行检测，分析我国DCD 供肾在低温机械灌注情况下的损伤特征及与肾移植预后的关联。

本研究基于本移植中心的DCD 肾移植案例建立起来的数据库，首次阐述灌注参数与灌注液生物标志物与DGF 之间的关联，研究发现NAG、GST在DGF 组平均浓度均较NO-DGF 组显著升高，IL-18 在DGF 组稍高于NO-DGF 组。同时多因素Logistic 回归分析显示终末阻力和GST 是DGF 的独立危险因素。考虑到灌注液中生物标志物的浓度不仅与肾脏缺血性损伤的程度有关，还与Lifeport 灌注供肾组织的范围有关［7］，因而考虑到灌注参数与灌注液生物标志物的交互作用，本研究进一步发现GST 与终末阻力存在交互作用，构建包含交互项的预测模型我们发现其预测能力相较于单独应用终末阻力和GST 得到改善。国外大多数研究报道没有综合灌注液生物标志物、灌注参数对肾移植预后进行分析。 Hall 等［17］的研究虽然对此进行了探讨，但是该研究包含了所有类别的尸体供肾，没有区分DCD 这一特殊类别，并且该研究没有分析灌注液生物标志物与灌注参数的交互作用。Hoogland 等［7］的研究虽然纳入了DCD 供体，但该研究的平均冷缺血时间〔（27±6）h〕和低温机械灌注时间〔（21± 6）h〕、平均热缺血时间〔（26±11）min〕均远远高于我国，可控制的DCD 比例也较低，这些情况并不适于我国国情。这些研究只是进行了简单的多因素回归分析，没有考虑灌注参数（灌注情况）对生 物标志物的影响。我国目前则尚无这方面的报道。

综上所述，我们详细分析了DCD 供肾Lifeport灌注参数与灌注液生物标志物的特征，以及与DGF 的关联，初步提出灌注参数（终末阻力）联合灌注液生物标志物（GST）可提高预测DGF 的能力。本研究不但为更加合理地应用低温机械灌注技术（Lifeport）、合理发挥Lifeport 指标的预测价值提供了科学依据，并对未来探索基于低温机械灌注技术的供肾维护、甚至改善策略具有重要意义。