阿尔茨海默病不同临床阶段血清中microRNA-124的动态研究*

张伟勇，杨美兰，颜雯，曾统，刘炜，程佳

1中山大学附属第八医院(深圳福田)老年病科(广东深圳 518033)； 2中山大学中山医学院生化教研室(广东广州 510080)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种临床表现为记忆认知和语言功能等障碍的神经退行性疾病，其发病的医学机制尚未明确，是目前导致老年痴呆的主要原因[1]。随着老年社会的到来和患病人数的剧增，对该病精准早期诊断及有效治疗的生物靶点研究成为热点。MicroRNAs是一种长约22个核苷酸的非编码单链小RNA，为基因表达的重要调控因子，在中枢神经系统内有丰富的表达并可借助外泌体等跨越血脑屏障释放到外周血，结合蛋白稳定存在于外周血[2]。研究表明microRNAs参与老年退行性疾病的发生过程，其中microRNA-124在神经系统疾病方面已经有大量的研究，在血清中稳定存在且其在循环血中的表达谱随着机体病理生理情况的改变而变化[3-4]。理论上我们推测与AD病理密切相关的microRNA-124在血清中可能也存在差异表达。本研究通过检测AD患者以及初诊AD患者治疗后不同时间与健康人的血清microRNA-124差异表达情况，试图寻找和证明一种可能作为辅助诊断AD的早期生物标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年8月至2019年8月就诊于中山大学附属第八医院老年及神经内科门诊的AD初步确诊患者36例，选取同期体检中心的健康体检者共30例为研究对象。分为对照组和病例组：对照组30例，男女各15例，年龄59～76岁；病例组36例，男18例，女18例，年龄62～78岁。各组研究对象在性别年龄及受教育年限方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

诊断标准[5]：病例组入选标准符合美国精神疾病诊断及统计手册第4版关于AD和血管性痴呆VD的诊断标准，所有患者均进行临床检查、精神状态检查(MMSE)量表测试积分≤26分。并符合国际疾病分类诊断标准第10次修订及美国国立神经疾病，语言障碍及卒中研究所和AD及相关疾病协会所制定的“很可能是AD”的诊断标准。

排除标准：(1)既往有脑血管疾病者及抑郁；(2)有颅脑外伤者；(3)合并心血管、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病，精神病患者；(4) 处于晚期状态的老年痴呆疾病；(5)有血液系统疾病者；(6) 血管性及其他原因所致痴呆；(7) 未知情同意者。正常对照组患者无血液病、恶性肿瘤、严重的肝肾功能不全、感染疾病等其他疾病。

组别例数性别(例)男女年龄(岁)教育年限(年)对照组30151566.1±1.36.9±1.1病例组36181865.3±1.57.2±1.5

1.2 方法

1.2.1 治疗 病例组为通过常规的西医治疗方式进行治疗，嘱患者晚上睡前服用口服盐酸多奈哌齐，1次/d，5 mg/次。

1.2.2 血清样本的收集处理和存储 病例组初诊确诊后采取静脉血，以后复查在初诊后1、2、3年不同时间点取静脉血。正常对照组静脉血来自来体检中心健康体检者，所有静脉血均在3 h内，于4℃、3 000 r/min离心10 min，提取血清后统一放入-80℃冰箱保存备用。

1.2.3 芯片检测 血清microRNA的提取按照操作说明提取分离试剂盒(广州晶伟公司DP501)，采用吸附柱法提取血清microRNA。抽取每例初诊组患者的等量RNA，充分混匀后抽提RNA进行microRNA芯片检测，采用Agilent高通量基因芯片技术，采用GO和KEGG pathway富集分析，并与正常组的microRNA芯片检测结果比较，数据通过Agilent GeneSpring GX software(version 11.5.1)进一步分析(NCBI对应注册号：NM_032567 NM_152689)，通过Volcano Plot筛选出显著差异表达基因，Hierarchical clustering比较样本间差异基因microRNAs表达水平。

1.2.4 血清microRNA-124水平检测[6]Real-time PCR法验证芯片检测结果，按照试剂盒mirVanaTMPARISTM Kit(Ambion)说明书操作提取血清中的microRNA。采用逆转录试剂盒One Step PrimeScript miRNA cDNA SynthesisKit(TaKaRa)引入Uni-miR qPCR Primer的位点，对样品中的cDNA进行定量反应。随即采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)对目的片段进行两步法扩增以准确定量。microRNA-124引物由武汉锐博公司提供。逆转录引物：microRNA-124，5′-GTCGTATCCAGTGCAGGG-TCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCATT-3′；U6，5′-AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3′。PCR 引物设计：miR-124，正向5′-GCTAAGGCACGCGGTG-3′，反向5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′ ；U6，正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。实时定量PCR检测在LightCycler 1.5仪器(瑞士Roche公司) 进行。以2-ΔΔCt表示每个microRNA的相对表达量，每例样本重复检测5次，实验过程中采用盲法研究。采用非参数方法受试者工作特征(ROC)曲线分析诊断AD的敏感度和特异度。分析microRNA-124相对水平变化与MMSE的相关性。

2 结果

2.1 基因芯片检测结果 通过芯片对8例AD患者和8例对照组(随机在病例组与对照组选取)血清microRNA进行定量检测，结果提示可筛选出22个AD相关的有明显意义的差异表达microRNAs基因(P<0.05)，见图1。16个表达下调的基因有microRNA-9、microRNA-200b、microRNA-124等；6个表达上调的是microRNA-3099、microRNA-762等。以两组间microRNA表达量的差异倍数，即相对表达量(log2)的绝对值>2.0且t检验P<0.01为筛选标准，发现microRNA-124的表达水平在AD患者中显著低于对照组(log2=-6.12，P=1.20×10-5)。

图1 AD组与正常组差异 microRNAs 聚类图

2.2 microRNA-124结果 AD初诊时0.66±0.29，初诊1年0.71±0.30，初诊2年1.11±0.25，初诊3年1.16±0.31，对照组1.96±0.33，与对照组比较，病例各组的microRNA-124水平明显低，差异有统计学意义(P=0.012)，见图2。两组倍数差值为2.13。病例组初诊时表达量仅为对照组的31%，组间差异有统计学意义(F=21.22，P<0.001)，结果与microRNA芯片检测结果一致；而病例组在治疗后不同时间之间差异无统计学意义(P>0.05)。

注：*与对照组比较P<0.05

2.3 microRNA-124对AD的诊断效能 当曲线下面积(AUC)为0.891 2[95%置信区间(CI)：0.839 1～0.913 1，P<0.000 1]，当截止值为1.215时，敏感度和特异度均为81.2%，见图3。microRNA-124相对水平变化与MMSE呈负相关性(r=-0.506，P<0.000 1) 。

图3 microRNA-124表达的ROC曲线

3 讨论

AD是最常见的老年痴呆症类型，主要病理表现以β淀粉样蛋白沉积形成的老年斑、tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结及大量神经元死亡为特征，该病的特点为起病隐匿、病情呈渐进性不可逆的进展[7]。目前AD的临床诊断主要依赖于神经心理学评分和标志物检测，由于缺乏早期客观诊断依据，使得大多数患者在疾病早期未得到正规诊治。体液标志物具有检测便捷、易于标准化等特点更加适用于早期筛查。近年来，microRNAs特别是外周血microRNAs的研究成为热点，有关AD患者血清microRNA-124的表达水平以及与临床治疗效果之间的关系研究极少。本研究发现microRNA-124在AD患者血清中表达水平显著低于健康人水平，并初步确定了通过microRNA-124辅助诊断AD的临界值，为临床诊断和治疗提供进一步新基础指标。

已有研究显示AD患者某些特定血清的microRNA表达谱与正常老年人相比存在显著差异。本研究在大样本中采用候选基因策略，对与脑组织病理改变密切相关的microRNA-124在血清中的表达进行验证，发现其表达病例各组明显低于对照组，提示其可以作为AD潜在的生物学标志物。microRNA-124是目前发现在脑组织中表达最为丰富的microRNA，占脑组织中microRNAs总量的1/4，对神经元的发育、分化具有重要作用。Li等[8]首次发现AD 患者脑组织中microRNA-124较正常老年人相比表达下降，其中发现在12例AD和10例正常对照老年人血清中验证了这一结果。在AD发病过程中，脑灰质和白质中microRNAs的表达也是不同的，其中microRNA-124在灰质中下调明显。Yeom等[9]发现AD和轻度认知功能障碍的患者中microRNA-124表达水平下降，与本研究结果一致。文献研究了血液中12种与AD 有关的microRNAs，其中microRNA-124也表达下降[8]。我们认为 microRNA-124可能通过以下相关机制影响AD的发生、发展：(1)Li等[10]研究发现AD进程中脑组织的microRNA-124的表达出现不同程度减少，而同时淀粉蛋白前β位分解酶表达增加从而出现相应的病理变化，认为microRNA-124可通过与靶基因BACE1 的3′端非翻译区(UTR)区结合调控的表达，继而增加APP水解后Aβ生成与沉积导致AD的发生，并可能通过调节BACE1 参与加速该病的进展；(2)microRNA-124诱导神经元细胞周期阻滞并重新进入细胞周期，重新进入细胞周期是AD发病的早期事件甚至发生在Aβ和神经纤维缠结形成之前导致AD的发生；(3)microRNA-124还通过降低控制APP和淀粉样斑块形成解聚素基质金属蛋白酶(ADAM) 10的表达来影响AD的发生[11]；(4)文献研究[12]还证实AD患者脑组织microRNA-124表达下降与老年斑下降相关。当然，microRNA-124影响AD的机制还需要多方研究。本结果充分显示AD患者治疗时间越长，microRNA-124相对表达水平越高，正常人高于AD患者，microRNA-124 水平与AD存在着显著负相关关系。

综上所述，本研究结果显示microRNA-124在AD 患者中的表达量显著降低，可能作为AD 的一种潜在的生物标志物。我们认为尽管人体内microRNA-124不是AD患者特异性血清标志物，但作为一种比较敏感的体液标志物对AD患者预后估测及治疗效果鉴定是一个有效的参数，可作为预后标志之一。