ABT-737对人急性髓细胞白血病细胞U937诱导凋亡作用及机制*

饶佳，高琳琳

南昌大学第一附属医院 1健康管理中心，2血液科(江西南昌 330006)

急性髓细胞白血病(AML)是由造血细胞增殖能力提高、分化阻滞、凋亡障碍而引起的一种恶性疾病，在我国发病率约为(2 176～4 000)/10万，呈逐年上升趋势，目前全国白血病患者已达400多万人，每年新增4万人[1-2]。在恶性肿瘤病死率中，白血病居第6位(男性)和第8位(女性)，在儿童及35岁以下成人中居第1位，严重威胁人民健康和生命安全。柔红霉素为主的化疗方案是目前临床治疗AML的主要手段，但大部分患者在治疗缓解后面临耐药复发[3]。同时，传统联合化疗存在的不足还有，化疗药物除了杀伤白血病细胞，还可影响正常造血细胞，化疗导致的贫血、出血、感染等骨髓抑制作用，也是导致患者死亡的主要原因。因此，寻找新型的靶向药物选择性杀伤白血病细胞、而赦免正常造血细胞，是当前AML治疗急需解决的问题。抗凋亡蛋白高表达是肿瘤细胞生存及耐药的重要机制之一，抑制抗凋亡蛋白能达到杀伤肿瘤细胞的目的。Bcl-2家族是凋亡的关键执行者，在线粒体依赖的凋亡通路中至关重要，Bcl-2高表达参与AML耐药[4-5]。Del等[6]对255例初治AML回顾性研究发现，Bax/Bcl-2比值与CR率、无病生存呈正相关。体外细胞实验也表明，化疗后生存下来的白血病细胞伴随Bcl-2基因抗凋亡因素的高表达。Bcl-2在肿瘤细胞高表达，正常造血组织表达水平低下，因此，靶向Bcl-2的治疗，有望克服传统化疗药物耐药、弥补化疗药物骨髓抑制作用的不足、提高AML治疗效果。ABT-737是Bcl-2家族蛋白拮抗剂，体外实验和异种移植模型实验提示，ABT-737可以抑制多种肿瘤细胞生长[7-8]，但关于ABT-737靶向治疗AML的研究报道不多。2018年11月至2019年10月期间，本研究探讨Bcl-2小分子抑制剂ABT-737在体外对AML细胞株U937的毒性作用，探讨其抑制增殖、诱导凋亡作用及可能分子机制。旨在为治疗AML提供治疗靶点、提高治疗效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 人AML细胞系U937购自ATCC；ABT-737(美国Sigma公司)；CCK-8(Sigma公司)；RPMI1640、胎牛血清(fetal calf serum，FBS)(美国Gibico公司)；小鼠抗人Bcl-2、GAPDH抗体(美国Protein Tech Group公司)；NC膜、Whatman 3mm滤纸(美国Bio-Rad公司)；发光液(瑞典Amershman Bioscience公司)；Pre-stained Protein Ladder(加拿大Fermentas公司)；丙烯酞胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、TEMED、DTT、溴酚蓝、甘氨酸、NP-40、Tween 20、Triton X-100(美国Sigma公司)。Annexiin-V/PI双染凋亡检测试剂盒(中国南京凯基生物科技发展有限公司)。Trizol(Invitrogen)；DEPC(上海生工生物工程有限公司)；乙醇、异丙醇、氯仿 (南京凯基)； DL2000分子量标记物(TaKaRa)；cDNA第一链合成试剂盒(北京天根)；PCR试剂盒(北京天根)。Bcl-2、β-actin引物序列由上海英峻生物技术有限公司设计及合成。

1.2 细胞培养和分组 U937细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养，于37℃、含5%CO2饱和湿度培养箱内培养传代。每天换液1次，待细胞生长至对数生长期时，用于实验。收集对数生长期细胞，采用不同浓度ABT-737(0、0.625、1.25、2.5、5.0、10 μmol/L)作用细胞24 h后，分别检测细胞的增殖、凋亡、Bcl-2基因和蛋白水平表达。

1.3 CCK-8检测细胞活性 我们使用CCK-8法检测了ABT-737作用24 h后U937细胞的生存率。取各组的U937细胞，计数板计数，调整细胞浓度至2×105个/mL，每孔加入0.2 mL(即4×104个/孔)，与浓度梯度ABT-737作用24 h。每孔加入20 μL CCK8检测液，设置空白对照孔，37℃避光反应1 h，450 nm处读取各孔OD值。实验结果按下式计算：细胞存活率=(实验组OD值-空白组OD值)/(不加药组OD值-空白组OD值)×100%。

1.4 Annexiin-V/PI双染检测细胞凋亡 我们进一步采用Annexin-V/PI双染、流式细胞仪检测ABT-737作用24 h后对U937细胞凋亡率的影响。取对数生长期细胞，按实验分组培养于6孔板中，与浓度梯度ABT-737作用24 h，作用结束后收集上述培养的细胞，PBS洗2次，离心后用100 μL 1×binding buffer重悬细胞。充分吹打混匀。每管加 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI，室温避光染色15 min，最后每管加400 μL 1×binding buffer，立即上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.5 半定量RT-PCR检测Bcl-2基因水平 收集各组细胞，用TRIZOL法提取总RNA。细胞加TRIZOL，反复吹打至均一，不能有团块。室温静置5 min。加0.1 mL的氯仿，盖好EP管，剧烈震荡15 s，室温静置2～3 min。4℃，10 500 r/min离心15 min。取上清至另一去酶的EP管，加入等体积异丙醇，用手颠倒至液体清亮，室温静置10 min。离心10 min，弃上清。RNA沉淀用500 μL的75%乙醇洗涤，漩涡混匀。离心5 min，弃上清。DEPC水溶20 μL分装，-80℃储存。依据cDNA第一链合成试剂盒说明进行逆转录反应。合成引物：Bcl-2上游：5′-CTGGTGGACAACATCGC-3′，下游：5′-GGAG-AAATCAAACAGAGGC-3′。内参照β-actin：上游：5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游：5′-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3′。反应体系：逆转录产物1 μL，10 μmol/L的上下游引物各1 μL，2×Master Mix 12.5 μL，灭菌双蒸水9.5 μL。PCR试剂盒进行PCR反应。取PCR产物10 μL，于2%琼脂糖凝胶(含1 μg/mL EB)电泳，110 V，30 min。在紫外灯下观察结果。

1.6 Western blot检测细胞Bcl-2蛋白 由于Bcl-2家族在凋亡调节中起了至关重要的作用，我们用RT-PCR法检测ABT-737对U937细胞Bcl-2 mRNA 水平的影响。收集各组细胞，根据总蛋白提取试剂盒提取蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度，取变性后的不同蛋白样品(含5×上样缓冲液)等量上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，电泳后把胶上的蛋白转移到NC膜，5%(W/V)牛血清白蛋白封闭1 h，孵育相应的一抗过夜，次日用TBST洗3次，10 min/次，二抗室温孵育 1 h，TBST 洗 3 次，10 min/次。洗涤后根据底物试剂盒要求将底物加到NC膜上显色，压片盒压片、定影、显影，胶片晾干后扫描。

1.7 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析,两两比较用SNK检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ABT-737对U937细胞增殖的抑制作用 ABT-737可显著抑制U937细胞生长，随着ABT-737浓度的增加，U937细胞数量逐渐减少。0、0.625、1.25、2.5、5.0、10 μmol/L ABT-737作用U937细胞24 h后，细胞的生存率分别为(100.00±0.00)、(90.61±6.79)、(86.84±6.23)、(78.51±9.22)、(74.69±12.71)、(58.40±12.44)%，差异有统计学意义(P<0.05)。其中2.5 μmol/L ABT-737即可使U937 细胞出现明显增殖抑制，作用24 h后其存活率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：*与0 μmol/L比较P<0.05

2.2 ABT-737对U937细胞诱导凋亡作用 ABT-737可显著诱导U937 细胞凋亡，随着ABT-737浓度的增加，凋亡率逐渐增加。0、0.625、1.25、2.5、5.0、10 μmol/L的ABT-737作用24 h后，U937细胞的凋亡率分别为(8.97±6.99)、(11.62±3.29)、(23.28±12.90)、(30.06±14.60)、(48.93±2.61)、(55.32±1.14)%，差异有统计学意义(P<0.05)。其中2.5 μmol /L ABT-737就能显著诱导U937细胞凋亡，作用24 h后U937 细胞凋亡率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2～3。

2.3 ABT-737下调U937细胞Bcl-2 mRNA水平 0、0.625、1.25、2.5、5.0、10 μmol/L的ABT-737与U937细胞作用24 h后，U937细胞的Bcl-2 mRNA水平有显著下调作用，见图4。

2.4 ABT-737下调U937细胞Bcl-2蛋白表达水平 0、0.625、1.25、2.5、5.0、10 μmol/L的ABT-737与U937细胞作用24 h后，Western blot结果显示，Bcl-2蛋白表达水平逐渐下降，5.0 μmol/L ABT-737作用细胞24 h即可完全抑制Bcl-2蛋白表达，见图5。

3 讨论

耐药复发是AML的治疗瓶颈。寻找新型的靶向治疗药物是提高疗效的关键。AML化疗抵抗的生存优势是多信号通路异常激活、抗凋亡蛋白和多药耐药蛋白过度表达等多重因素累积的结果。抗凋亡蛋白Bcl-2是目前研究最广泛的抑制凋亡基因，可以保护肿瘤细胞逃逸凋亡[9]，是抗肿瘤治疗的关键靶点之一。

图2 ABT-737对U937细胞流式检测结果

注：*与0 μmol/L比较P<0.05

Bcl-2是控制细胞凋亡基因家族中的一员。定位于人类染色体18q21.3，由3个外显子组成，编码229个氨基酸组成的膜蛋白，具有抗凋亡作用。Bcl-2在许多血液肿瘤过表达，但在正常造血细胞表达阴性。Bcl-2高表达明显延长白血病细胞生存时间，抑制或阻断多种因素包括p53、生长因子等所触发的细胞凋亡[10]。本课题组前期研究也表明，AML各细胞株均伴有不同程度Bcl-2高表达，而正常造血祖细胞Bcl-2表达低下，Bcl-2过表达通过抑制caspase-3 激活，参与了AML 耐药[10]。我们前期研究阐明了Bcl-2 过表达导致AML细胞凋亡逃逸、化疗耐药，这些特点提示通过选择性抑制Bcl-2信号通路而诱导AML凋亡的靶向治疗是可行的，为临床治疗AML提供了靶点[11]。因此，我们基于前期筛选出的耐药分子靶点、进一步探索药物靶向治疗。本课题采用Bcl-2小分子抑制剂ABT-737作用于AML细胞，观察不用浓度梯度ABT-737对U937细胞增殖抑制及诱导凋亡作用。

以Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白为靶点设计的小分子抑制剂，被称为BH3(Bcl-2 homology 3)类似物，是一类新的抗肿瘤制剂。ABT-737是Bcl-2家族蛋白拮抗剂，由美国Abbott实验室研发。Bcl-2 家族成员具有BH结构域的特征性序列，ABT-737是BH3结构域模拟分子，能特异性地结合于抗凋亡Bcl-2蛋白的疏水沟槽内，从而发挥促凋亡效应[10]。ABT-737对抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl和Bcl-w具有较高亲和力。ABT-737不但可以直接诱导细胞色素C释放而启动凋亡，还可通过提高其他细胞死亡信号的凋亡效应而发挥抗肿瘤作用。ABT-737能有效地杀伤小细胞肺癌细胞、肝脏肿瘤和许多血液系统恶性肿瘤如：多发性骨髓瘤[12]、急性淋巴细胞白血病[13]。对动物模型的研究也发现，ABT-737可以显著抑制小鼠模型异种移植的急性淋巴细胞白血病生长[14]。ABT-737 在体内和体外实验中都具有很好的抗肿瘤活性，已进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验阶段，提示了ABT-737良好的抗肿瘤应用前景。

图5 ABT-737对U937细胞Bcl-2蛋白表达水平影响

本研究将ABT-737应用于AML细胞U937，研究结果显示，ABT-737可显著抑制AML U937细胞生长，10 μmol/L ABT-737作用24 h后，U937 细胞存活率为(58.40±12.44)%，与对照组比较差异有统计学意义。ABT-737显著诱导U937细胞凋亡，随着ABT-737浓度的增加，细胞数量逐渐减少。10 μmol/L ABT-737作用24 h后，U937细胞凋亡率可达(55.32±1.14)%。文献表明，ABT-737对抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl和Bcl-w具有较高亲和力。我们进一步采用RT-PCR和Western blot方法检测Bcl-2基因和蛋白表达，结果显示，ABT-737可以显著抑制Bcl-2 mRNA 水平和蛋白表达水平。进一步证实ABT-737诱导U937细胞凋亡是通过内源性通路发挥作用的。

综上所述，本文进一步在前期研究的基础上证实了ABT-737对AML细胞U937有增殖抑制和诱导凋亡作用，其诱导凋亡作用通过抑制Bcl-2 mRNA 水平和蛋白表达实现。该研究为治疗AML提供了治疗靶点，有望提高AML的治疗效果，为AML化疗提供治疗新思路。今后的研究将进一步把ABT-737应用于荷瘤小鼠模型和AML原代细胞中，进一步阐明其对AML的体内外抗肿瘤作用，为临床治疗提供研究基础。