S1pr1沉默对弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-LY1细胞增殖和迁移的影响

周颖 罗婷 袁韵 龚玉萍

弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是成人最常见的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，约占NHL的30%～40%[1]。目前，R-CHOP是DLBCL的标准治疗方案，治愈率可达到60%[2]。尽管R-CHOP的成功治疗效果有所改善，但复发和难治性疾病的患者仍是该疾病治疗的一大挑战。近年来，高通量技术揭示了DLBCL基因改变的更复杂特征，并发现了新的治疗途径。DLBCL靶向治疗的候选通路之一是STAT3通路[3]。STAT3在包括血淋巴样恶性肿瘤在内的许多癌症中被活化[4]。STAT3激活， 活化的STAT3(phospho-STAT3,p-STAT3)进入细胞核，导致细胞凋亡、增殖[5]。免疫组化检测到的STAT3或p-STAT3单独表达是所有DLBCL患者的不良预后因子[6]。S1pr1是鞘氨醇-1-磷酸(S1P)G蛋白偶联受体的成员，通过调控ERK、Akt和Rac通路分别引起细胞增殖和迁移等多种生物学效应[7]。最近有据报道显示，S1pr1也转录p-STAT3和增强S1pr1随后地激活STAT3，建立一个积极的反馈回路，包括S1pr1/p-STAT3途径，这对于小鼠和人实体瘤以及肿瘤相关骨髓细胞STAT3的持续激活至关重要[8]。霍奇金淋巴瘤(HL)和NHL在细胞系或组织中均有S1pr1的表达，提示S1pr1在这种情况下具有潜在的生物学作用[9]。然而，S1pr1在DLBCL患者中的预后研究鲜有报道。本研究通过沉默OCI-LY1细胞中S1pr1基因的表达，观察OCI-LY1细胞增殖和迁移情况，并初步探讨其可能的机制，为 DLBCL 的治疗提供一个新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂及仪器 人DLBCL OCI-LY1细胞 (中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库)；S1pr1特异性siRNA和阴性对照(negative control，NC)(上海吉玛生物科技有限公司)；DMEM 培养基、胰酶、胎牛血清(美国Gibco公司)；细胞计数试剂盒8(CCK-8)(美国Amresco公司)；人淋巴细胞分离液(上海博升生物科技有限公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反转录试剂盒(大连TaKaRa公司)、UltraSYBR One Step RNA PCR Kit荧光定量PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司)；PCR引物序列设计和合成(大连TaKaRa公司)，引物编号：S1pr1(002215-PN4426784)、β-actin(001973-PN4427975)；细胞蛋白抽提试剂(碧云天生物技术研究所)；鼠抗S1pr1、STAT3、p-STAT3(美国Santa Cruz公司)；鼠抗GADPH单克隆抗体和辣根过氧化物酶HRP标记山羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Westen blot试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；CO2培养箱(美国Ther-mo Revco)；HBS-1096B 酶标仪(南京德铁实验设备有限公司)；Transwell小室(CORNING科技有限公司，美国)；基质胶、凝胶成像仪(美国UVP 公司)；实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD公司)；BIO-RAD垂直电泳仪(美国BD公司)；NanoDrop2000c 型蛋白核酸检测仪(美国Thermo公司)。

1.2 标本来源 收集我院确诊为DLBCL的患者10例，同时选择10例健康者外周血，利用淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞，加入1 ml Trizol，-80℃保存备用。本研究经我院伦理委员会批准，受试对象均签署知情同意书，严格按照《赫尔辛基宣言》执行。

1.3 细胞培养及转染 用含胎牛血清的DMEM培养液培养OCI-LY1细胞，隔天换液，当细胞处于对数生长期时进行实验。实验分为空白对照组、阴性对照组和S1pr1沉默组。空白对照组在铺板后72 h收获细胞，阴性对照组和S1pr1沉默组分别用Lipofectamine法将阴性对照(negative control，NC)和S1pr1特异性siRNA转染到OCI-LY1细胞，继续培养72 h后进行相关检测。

1.4 细胞增殖实验 按照1.3方法处理细胞，消化后以5×103/孔接种于96孔板中，200 μl/孔，继续培养72 h，向培养板中加入10 μl CCK-8试剂，继续培养，用酶标仪在630 nm处测定吸光度值，计算细胞增殖率，每组设3个平行孔。

1.5 细胞迁移能力实验 按照1.3方法处理细胞，继续培养72 h，用不含血清培养基的重悬，调整浓度为2×105后接种在24孔Transwell小室中，每孔100 μl，下室加入10%胎牛血清的DMEM培养液，弃上室培养基，用无菌棉签擦拭去除上室内的细胞，进行固定，用结晶紫染色30 min，冲洗干净后显微镜下观察细胞，拍照。计数紫色染色的穿膜细胞，即细胞迁移能力，每组设3个平行孔。

1.6 RT-PCR检测S1pr1 mRNA表达 取保存的外周血标本和按照1.3方法处理细胞，根据Trizol提取试剂盒操作说明书进行总RNA提取，反转录合成cDNA，制备20 μl反应体系进行扩增。PCR 扩增反应条件为 95℃ 30 s，93℃ 10 s，60℃ 3 s，40个循环，60℃时采集荧光，以β-actin作为内参，采用 2-ΔΔCt法计算S1pr1表达量。

1.7 Western Blot法检测S1pr1、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平 按照1.3方法处理细胞，消化后5 000 r/min、5 min离心，洗涤2次，加入1 μl PMSF，根据细胞量加入胞蛋白抽提试液，冰浴2 h；4℃、10 000 r/min、15 min，取上清，进行蛋白定量；进行电泳、切胶；孵育一抗、孵育二抗，用凝胶成像系统采集图像并进行分析，计算目的蛋白与内参蛋白条带的灰度值比值。

2 结果

2.1 DLBCL患者及健康者外周血单个核细胞中S1pr1 mRNA的表达 DLBCL患者外周血单个核细胞中S1pr1 mRNA相对中位表达水平为13.02(0.54～31.28)，高于健康者的0.74(0.07～5.67)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 S1pr1沉默对OCI-LY1细胞S1pr1 mRNA和蛋白表达的影响 与空白对照组比较，阴性对照组OCI-LY1细胞中S1pr1 mRNA和蛋白表达变化不显著，差异无统计学意义(P>0.05)；S1pr1沉默组OCI-LY1细胞中S1pr1 mRNA和蛋白表达较空白对照组和阴性对照组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2,图1。

表1 DLBCL患者及健康者外周血单个核细胞中S1pr1 mRNA的表达 n=10

注：与健康者比较，*P<0.05

表2 S1pr1沉默对OCI-LY1细胞S1pr1 mRNA和蛋白表达的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05

图1 S1pr1沉默对OCI-LY1细胞S1pr1蛋白表达的影响；A.空白对照组；B.阴性对照组；C.S1pr1沉默组

2.3 S1pr1沉默对OCI-LY1细胞增殖和迁移的影响 与空白对照组比较，阴性对照组OCI-LY1细胞增殖率和迁移细胞数变化不显著，差异无统计学意义(P>0.05)；S1pr1沉默组OCI-LY1细胞增殖率和迁移细胞数较空白对照组和阴性对照组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3,图2。

表3 S1pr1沉默对OCI-LY1细胞增殖和迁移的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05

ABC

图2 S1pr1沉默对OCI-LY1细胞迁移的影响(×200);A.空白对照组；B.阴性对照组；C.S1pr1沉默组

2.4 S1pr1沉默对OCI-LY1细胞STAT3和p-STAT3蛋白表达的影响 与空白对照组比较，阴性对照组OCI-LY1细胞STAT3和p-STAT3蛋白表达变化不显著，差异无统计学意义(P>0.05)；S1pr1沉默组OCI-LY1细胞STAT3和p-STAT3蛋白表达较空白对照组和阴性对照组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4,图3。

表4 S1pr1沉默对OCI-LY1细胞STAT3和p-STAT3蛋白表达的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05

图3 S1pr1沉默对OCI-LY1细胞STAT3和p-STAT3蛋白表达的影响;A.空白对照组；B.阴性对照组；C.S1pr1沉默组

3 讨论

近十年来，基因干预已成为癌症生物学研究的热点分子，许多目标基因在肿瘤发生和肿瘤发展中发挥着重要作用。科学家们开始主张通过基因靶向干预，以此作为治疗各种恶性肿瘤的新靶点。STAT3在不同的肿瘤中被活化，但其在DLBCL中的作用尚不清楚。尽管STAT3是一个很有前景的癌症治疗靶点，但由于其细胞内定位和缺乏酶活性，有效抑制转录因子的活性仍然是一个挑战[10]。

最近，一种G蛋白偶联受体S1pr1被发现对某些小鼠肿瘤和人类肿瘤细胞中STAT3的持续激活非常重要。S1pr1可与JAK2发生物理作用，导致STAT3磷酸化增加，p-STAT3可在转录水平上调S1pr1的表达，形成前馈循环[11]。STAT3的活化也受白细胞介素6(IL-6)等因素的影响，进一步导致S1pr1过表达[12]。与STAT3相比，S1pr1具有更有利的细胞定位和酶标靶能力。然而，S1pr1在癌症生物学中的重要性才刚刚开始被认识，其作为人类癌症治疗靶点的潜在重要性还有待进一步评估。在本研究中，我们关注的是S1pr1在DLBCL中的表达和功能。

S1pr1对T淋巴细胞和B淋巴细胞保留在次生淋巴器官中起着至关重要的作用。S1pr1在内皮细胞中也有高表达，这些细胞中S1pr1的表达对肿瘤血管生成和转移具有重要意义[13]。另一方面，阻断S1pr1可使淋巴瘤细胞保留在淋巴器官中，这是由于S1pr1存在功能缺陷，这可能会限制淋巴瘤细胞的侵袭潜能[14]。S1pr1信号可以被一种有效的抑制剂FTY720阻断，FTY720是一种免疫抑制剂，目前正被用于治疗多发性硬化症[15]。除了靶向该通路的药物FTY720外，S1P配体抗体也被证明可以有效抑制多种小鼠模型的原发性肿瘤生长，近期已进入其他适应症的临床试验[16]。由于已知S1P/S1pr1信号通路与多个重要通路相关，包括T细胞中的mTOR通路和非淋巴细胞中的Akt通路，因此，S1pr1通过STAT3信号通路以外的机制在DLBCLs生物学中的可能作用尚待阐明[17]。另一种可能是使用一种新的体内siRNA干扰技术，利用S1pr1 siRNA不仅可以靶向抑制肿瘤细胞中的S1pr1/STAT3信号，还可以通过激活肿瘤相关的树突状细胞、巨噬细胞和B细胞，同时增强抗肿瘤免疫应答[18]。将STAT3与S1pr1共定位于ABC DLBCL组织的肿瘤细胞中，通过S1pr1 siRNA抑制S1pr1成功抑制了STAT3的活性和肿瘤细胞的生长。在目前DLBCL患者的临床的研究中发现，S1P/S1pr1通路的激活导致DLBCL病情的恶化，因此，除了STAT3，S1P被认为是一个有前途的目的蛋白[19]。有趣的是，最近的一项研究显示，S1pr1/STAT3信号通路是慢性肠道炎性和结肠炎相关癌症之间的重要联系。考虑到S1pr1/STAT3通路在炎性反应和炎性相关癌变中的重要作用，提示S1pr1/STAT3通路可能参与炎性易发区域的淋巴生成[20]。本研究结果显示，通过沉默S1pr1基因，降低了STAT3和p-STAT3的水平，同时导致OCI-LY1细胞增殖和迁移能力被抑制。

综上所述，沉默OCI-LY3细胞S1pr1基因可调节STAT3的活性水平，抑制OCI-LY3细胞增殖能力，降低OCI-LY3细胞的迁移能力，为DLBCL的治疗提供了一个新的靶标。然而，我们还需要进一步阐明S1pr1功能在DLBCL治疗中的具体机制，以验证我们的发现。