澳洲茄胺抑制人骨肉瘤细胞生长的实验研究

曾斌 黄云川 曹晓磊 苟林

骨肉瘤(osteosarcoma)是原发恶性骨肿瘤，主要发生于儿童期，需通过手术治疗，并辅以化疗改善患者的生存情况，但其5年生存率仅为5%～20%[1]。骨肉瘤恶性程度高，极易发生扩散和转移，是预后差的重要因素，因此研究骨肉瘤的发生机制及侵袭转移机制成为研究的热点[2]。肝癌、肺癌、肠癌等研究中发现澳洲茄胺具有抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡的作用[3-5]。同时在易扩散和转移的肺癌和肠癌中发现，澳洲茄胺具有抑制肿瘤侵袭转移的作用[6,7]，但目前澳洲茄胺对骨肉瘤的作用尚不可知。AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路在诸多研究报导是肿瘤细胞增殖、调亡、侵袭和迁移的交汇点，是参与肿瘤发生发展等过程的重要信号通路之一[8-10]。因此本文研究了澳洲茄胺对骨肉瘤细胞增殖、调亡和侵袭转移生物学功能影响，并对其机制进行探讨，为进一步揭示澳洲茄胺抗肿瘤作用靶点及临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与处理 人骨肉瘤细胞MG-63的培养：购买于ATCC，是一株贴壁细胞，使用10%胎牛血清 (Gibco)的DMEM培养液 (Gibco)培养于37℃、5% CO2培养箱中。澳洲茄胺处理：将细胞接种于孔板中，于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h，加入一定浓度的澳洲茄胺，于培养箱中培养48 h。

1.2 MTT实验 MG-63细胞接种于96孔板培养24 h后，用含不同浓度澳洲茄胺的培养基替换原培养基，每个浓度设复孔3个，并设空白对照组，孵育48 h后向每孔加MTT液孵育1 h，然后加入20% SDS后测各孔光密度值。实验重复3次以上取平均值。

1.3 细胞凋亡 MG-63细胞接种于6孔板培养24 h后，用含不同浓度澳洲茄胺的培养基替换原培养基培养48 h，再用胰酶消化并收集细胞，PBS洗2次并收集细胞，后续步骤根据Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(生工)说明书操作。

1.4 Transwell实验 迁移实验：胰酶消化骨肉瘤细胞，分装成两管，分别用无血清DMEM培养基 (对照组)和含50 μmol/L澳洲茄胺的无血清DMEM培养基(实验组)重悬，并使细胞终浓度为1×106个/ml。取100 ml细胞悬液加入transwell上室，在细胞下室24孔板中加入500 ml含10% FBS的DMEM培养基，每组设3个复孔。48 h后取出小室，吸弃上室培养基，用棉签轻拭去上室细胞，结晶紫染色5 min，PBS洗涤3次。在光学显微镜下，在五个随机区域对侵入的细胞进行计数。侵袭实验：预先用无血清DMEM稀释Matrigel至终浓度为100 μg/ml，铺于Transwell小室底部，4℃风干。每孔加入50 ml含10 g/L BSA的无血清DMEM，于37℃培养箱放置30 min水化基底膜，其余步骤同迁移实验。

1.5 Western blot 用IP裂解液(Thermo Fisher Scientific)裂解并收集细胞，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒 (碧云天)检测总蛋白浓度。加入适量的SDS-PAGE上样缓冲液 (碧云天)，100℃沸水浴10 min，置于冰上冷却。取20 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，并转移到硝酸纤维膜上，在室温下用5%的脱脂奶粉封闭2 h，然后用HMGB1、TLR4、NFκB的一抗4℃孵育过夜。PBST洗涤3次后，用对应的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h。洗涤3次后，用ECL显色液 (碧云天)显色，于凝胶成像仪器下曝光和拍照。使用Image J软件测定灰度值。

2 结果

2.1 澳洲茄胺对MG-63增殖的影响 MTT结果显示，在相同的处理时间内，澳洲茄胺处理后细胞的抑制率显著增加，且随浓度增加抑制率越高；在相同浓度澳洲茄胺处理条件下，细胞抑制率则随时间延长而不断上升(P<0.05)。通过澳洲茄胺处理48 h时澳洲茄胺浓度与细胞抑制率趋势线，计算出澳洲茄胺对MG-63的半抑制浓度为54.03 μmol/L。见表1，图1。

表1 澳洲茄胺对MG-63抑制率的影响

注：与0 μmol/L比较，*P<0.5；与10 μmol/L比较，#P<0.05；与20 μmol/L比较，△P<0.05；与40 μmol/L比较，☆P<0.05；与60 μmol/L比较，▲P<0.5

2.2 澳洲茄胺处理细胞，检测细胞凋亡情况 应用Annexin-V/PI双染法检测澳洲茄胺处理前后MG-63细胞调亡率发现：用50 μmol/L澳洲茄胺处理组的细胞早期凋亡率(7.83±1.28%)和晚期凋亡率(15.03±1.24%)均明显高于对照组的早期凋亡率(3.23±0.84%)和晚期凋亡率(3.62±0.61%)，差异均有统计学意义(P<0.01)。用50 μmol/L澳洲茄胺处理组的细胞总凋亡率(22.74±0.58%)明显高于与不用澳洲茄胺处理的对照组的细胞总凋亡率(6.71±0.12%)，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图2。

2.3 澳洲茄胺处理细胞，检测细胞侵袭转移情况 Transwell实验结果显示，50 μmol/L澳洲茄胺处理过的细胞迁移能力(294±8)个/视野与侵袭能力(181±16)个/视野均明显低于对照组细胞迁移能力(406±13)个/视野和侵袭能力(295±10)个/视野，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图3。

图1 澳洲茄胺处理48 h时，澳洲茄胺浓度与细胞抑制率的关系

图2 Annexin-V/PI双染法检测澳洲茄胺处理前后MG-63的细胞调亡率

2.4 澳洲茄胺对骨肉瘤细胞AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路的作用 Western blot结果显示，与对照组相比，AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路中AKT、GSK-3β、β-catenin蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，澳洲茄胺处理组的pAKT(灰度值：72.724，t=37.90,P<0.01)、pβ-cateninze(灰度值：119.606，t=41.82,P<0.01)均显著低于对照组PAKT(灰度值：131.510)、pβ-cateninze(灰度值：135.544)，并且澳洲茄胺处理组pGSK-3β(灰度值：49.612)显著高于对照组(灰度值：49.344)。见图4。

图3 澳洲茄胺对细胞迁移和侵袭能力的影响；A Transwell检测2组细胞的迁移情况；B Transwell检测2组细胞的侵袭情况

图4 澳洲茄胺处理前后AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路活化情况； A Western blot检测2组细胞中AKT、GSK-3β、β-catenin、pAKT、pGSK-3β和pβ-catenin的蛋白情况；B 灰度分析Western blot检测结果

3 讨论

骨肉瘤以纺锤形的恶性肿瘤细胞形成不成熟的骨为病理特点，是原发恶性骨肿瘤，在儿童期最为多见[1]。目前治疗方法以手术为主，辅以化疗改善患者的生存情况[3]。但由于骨肉瘤本身恶性程度高、对化疗不敏感、极易发生转移等特点，截肢后5年生存率并不理想[2]。目前针对骨肉瘤发生机制、耐药问题以及转移侵袭相关机制的研究越来越多的受到关注。因此通过本研究对骨肉瘤生长、侵袭转移的研究，有助于控制肿瘤的发生与转移，提高患者生存率，对骨肉瘤治疗和预后评估等具有重要的临床意义。

研究发现以龙葵为主要药物组成的灌肠方治疗肠癌疗效显著[11]。进一步研究显示灌肠方的水提物和醇提物中均检测到龙葵的活性成分澳洲茄胺、澳洲茄碱及澳洲茄边碱，其中前者是后二者水解后的苷元，这三种成分在肠癌治疗中均显示了较强的药理活性[12,13]。澳洲茄胺是来源于茄属植物的一种甾体生物碱，具有多种药理活性，其抗肿瘤活性是目前研究的热点之一[14]。已有研究发现澳洲茄胺对肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、胶质瘤细胞增殖均有抑制作用，对乳腺癌、口腔表皮样癌、慢性粒细胞白血病、前列腺癌细胞凋亡均有促进作用，但作用机制尚未明确[14-18]。本文以骨肉瘤MG-63细胞为研究对象，探讨澳洲茄胺对骨肉瘤细胞的生物学行为的影响，结果发现澳洲茄胺具有抑制骨肉瘤细胞MG-63的增殖和侵袭转移的作用，并且能够诱导细胞凋亡，这将为今后临床治疗骨肉瘤提供新的理论参考。

AKT/GSK-3β/β-catenin是PI3K与Wnt两条信号通路的关键分子交汇成的一条通路，调控着肿瘤细胞的生物学行为[8]。在结直肠癌研究中发现，AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路的活化能够诱导肠癌细胞上皮间质化的发生，进而促进肠癌细胞的侵袭转移[19,20]。另有在结直肠癌研究中肠癌细胞的增殖抑制、细胞调亡、周期阻滞与AKT磷酸化减弱，GSK-3β活性增加，胞浆内β-catenin的降解密切相关[19,20]。本文研究发现澳洲茄胺对骨肉瘤细胞MG-63的增殖、凋亡和侵袭转移作用，可能与AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路的活化相关。本研究初步探讨了澳洲茄胺对人骨肉瘤细胞的生物学作用及机制，但是仍然有许多不足之处：(1)本研究发现澳洲茄胺对MG-63细胞的生长发挥着重要作用，但澳洲茄胺是否普遍作适用于其他骨肉瘤细胞，尚不可知；(2)本研究发现澳洲茄胺通过AKT/GSK-3β/β-catenin影响细胞增殖、凋亡和侵袭转移，但缺乏信号通路下游分别调控细胞增殖、凋亡和侵袭转移的蛋白的研究；(3)澳洲茄胺调控AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路的机制，还需要进一步探讨；(4)本文仅在细胞水平探讨澳洲茄胺对骨肉瘤的作用，实验结果的稳定性和可靠性均不如动物实验，因此仍然需要进一步构建体内动物模型以验证结论。

综上所述，澳洲茄胺通过活化AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路诱导细胞凋亡、抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭转移，进而可能控制骨肉瘤的发生与转移，提高骨肉瘤患者生存率。