黄芪提取物对心肌梗死大鼠血清cTnI、TGF-β1的影响

张建新 胡大军 杜巍 钟敏

心肌梗死具有发病率高、病死率高、病情进展快和预后差的特点，临床治疗主要是通过缩小心肌梗死的面积，降低机体心肌受损的程度，从而使心肌梗死导致的死亡率降低，但治疗效果并不是很理想[1]。黄芪作药用在我国已有两千多年的历史，对阳气虚弱、气虚乏力、阴虚盗汗等症状具有一定的治疗价值[2]。cTnI是能够反映心肌损伤和心肌细胞坏死的一种标志物，属于心肌的特异性蛋白，主要的存在场所是心肌收缩蛋白肌丝中，在心肌的收缩和舒张中发挥重要的调节作用[3]。TGF-β1是一种十分关键的促纤维化生长因子，在机体心肌重构以及纤维化形成过程中发挥着重要作用[4]。本文研究中设计实验，使用黄芪提取物对心肌梗死模型大鼠进行干预，旨在探究其对心肌梗死模型大鼠的干预效果及对cTnI、TGF-β1水平的影响。

1 材料与方法

1.1 研究动物 选取30只SD健康雄性大鼠，由广西医科大学实验动物中心提供，年龄3～6个月，平均年龄(4.0±1.5)月，体重200～248 g，平均体重(219±7.8)g。所有大鼠养殖在干净笼子内，室温保持在(22.1±1.8)℃，相对湿度35%～40%，每天保持12 h光照，喂饮纯净水，饲养时间1周。本文研究所做实验获得我院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 黄芪提取物(天根生化科技有限公司)；兔抗大鼠cTnI、TGF-β1抗体(Sigma公司)兔抗小鼠p-AKT抗体(Invitrogen公司)；大鼠抗小鼠Bcl-2、Bax抗体(Hyclone公司)；ELISA试剂盒(上海国药集团化学试剂有限公司)；HE染色剂、PBS缓冲液(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 建模及处理：随机选取10只大鼠作为正常组，不做任何处理。对剩余20只大鼠进行心肌梗死模型建立：使用浓度为1%的40 mg/kg戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，使用碘酒消毒后将背位固定，切开喉管插入气管，与呼吸机连接，在大鼠左胸第3和4段肋骨之间用剪刀横切，再用镊子进行分离后打开胸腔，使心脏充分暴露。将心包膜剪开，使用无创兴5-0号缝线将冠状动脉前支进行结扎，待心脏搏动减弱，Ⅱ导联心电图开始变化，ST段出现明显上抬，直到抬高到弓背向上，即为造模成功。最终建模成功18只，将18只心肌梗死模型大鼠随机分为心肌梗死组、黄芪干预组，每组9只。对黄芪干预组模型大鼠使用黄芪提取物进行灌胃处理，剂量为40 mg/kg，正常组与心肌梗死组大鼠使用等量0.9%氯化钠溶液进行灌胃处理。对3组大鼠均连续干预4周，观察效果。

1.3.2 心功能指标检测：使用10%的水合氯醛溶液(0.3 ml/kg)对所有大鼠进行腹腔内注射、麻醉，使大鼠保持仰卧位并进行固定、剃毛。将大鼠的躯体向左倾斜30°左右，并将多普勒超声检测仪探头置于大鼠胸骨的左侧，使探头与大鼠胸骨中线部位保持10°～30°夹角。检测指标包括舒张末期左心室后壁厚度(LVPWDd)、舒张末期室间隔厚度(IVSDd)、左心室舒张末期内径(LVEDd)、左心室收缩末期内径(LVESd)，并对左心室射血分数(EF)以及左心室短轴缩短率(FS)进行计算。

1.3.3 HE染色处理：3组大鼠全麻，采用断头法处死，取心尖部心肌组织，液氮冷冻后用甲醛浸泡固定，然后进行组织切片。对3组大鼠切片样本进行染色处理，使用二甲苯进行常规脱蜡处理2次，每次5 min，然后在梯度乙醇下水花处理3 min，自来水冲洗1次；使用苏木素染色5 min，自来水冲洗1次；使用浓度为1%的盐酸乙醇分化处理30 s，在0.2%氨水中反蓝处理2 min，自来水冲洗1次；在浓度0.5%伊红染色10 min，自来水冲洗1次；使用乙醇梯度进行脱水处理，最后用中性树胶进行封片，使用光学显微镜进行图像分析。

1.3.4 酶联免疫吸附试验法检测cTnI、TGF-β1水平：采用50 mmol/L碳酸盐包被缓冲液将抗原进行溶解，浓度10～20 μg/ml，在96孔酶标板中加入100 μl/孔，4℃过夜保存。第2天舍弃包被液，采用PBST洗涤3次，每孔中加入1%的150 μl BSA，在37℃环境中封闭1 h。之后采用PBST洗涤3次，在每孔中加入100 μl不同倍比稀释度的血清，加入对照样品，37℃孵育2 h。采用PBST洗涤5次，加入100 μl,稀释后的HRP标记的二抗，37℃孵育1 h。PBST洗涤5次后，使用显色剂显色20 min后，在酶标仪上读取A405吸收值。

1.3.5 Western blot法检测p-AKT、Bcl-2及Bax相对表达量：将采集到的标本，使用PBS缓冲液清洗3遍以上，分离缓冲液，加入IP细胞裂解液，进行裂解35 min，提取总蛋白，BCA测定蛋白浓度。取20 μg/孔蛋白质，通过10%的SDS-PAGE凝胶进行电泳，加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白缓冲液15 min；100 V,电泳10 min，结束之后，将电转膜浸泡在10%的牛奶中，在37℃环境下的摇床上封闭1.5 h；与一抗结合，加入TBST稀释按1∶1 000稀释一抗Tubulin(内参照)，在4℃的环境下孵育过夜保存；第2天用TBST缓冲液清洗，与二抗结合在室温下孵育1 h，再次用TBST缓冲液清洗反复清洗。最后加入显影剂将其浸在底物溶液中进行显色，使用BCA蛋白定量试剂盒对目的蛋白灰度值进行分析，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。

2 结果

2.1 3组大鼠心肌病理组织学观察 对3组大鼠心肌组织病理组织图进行观察。可见正常组大鼠心肌结构清晰，心肌纤维排列整齐且胞质丰富均匀，细胞间隙正常，未发现心肌纤维破坏现象；心肌梗死组大鼠可见多数炎性细胞浸润，呈现出大面积局灶性梗死瘢痕，心肌纤维断裂；黄芪干预组大鼠局灶性梗死瘢痕面积缩小，心肌纤维数量增多，心肌损伤获得改善。见图1。

2.2 3组大鼠各项心功能指标比较 心肌梗死组大鼠心功能指标LVPWDd、IVSDd、LVEDD、LVESd均显著高于正常组，黄芪干预组大鼠心功能指标LVPWDd、IVSDd、LVEDD、LVESd均显著低于心肌梗死组，高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；心肌梗死组大鼠心功能指标EF、FS水平均低于正常组，黄芪干预组大鼠心功能指标EF、FS水平均高于心肌梗死组，低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图1 3组大鼠心肌组织病理组织学观察(HE×200)

表1 3组大鼠各项心功能指标比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与心肌梗死组比较，#P<0.05

2.3 3组大鼠心肌组织cTnI、TGF-β1水平比较 心肌梗死组大鼠心肌组织cTnI、TGF-β1水平均高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；黄芪干预组大鼠心肌组织cTnI、TGF-β1水平均高于正常组，低于心肌梗死组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠心肌组织cTnI、TGF-β1水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与心肌梗死组比较，#P<0.05

2.4 3组大鼠细胞凋亡相关蛋白p-AKT、Bcl-2及Bax相对表达量比较 心肌梗死组大鼠细胞凋亡相关蛋白p-AKT、Bcl-2相对表达量均显著高于正常组，Bax相对表达量低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；黄芪干预组大鼠细胞凋亡相关蛋白p-AKT、Bcl-2相对表达量均显著高于正常组，低于心肌梗死组，Bax相对表达量低于正常组，高于心肌梗死组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组大鼠细胞凋亡相关蛋白p-AKT、Bcl-2及Bax相对表达量比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与心肌梗死组比较，#P<0.05

3 讨论

临床医学中将冠状动脉缺血、缺氧而导致的心肌坏死症状称为心肌梗死[5]。心肌梗死症状的主要临床表现为胸骨后疼痛，且疼痛感剧烈持久，对患者的生活质量造成严重的影响，且心肌梗死症状很有可能会并发心律失常、心力衰竭等症状，对患者的生命安全造成严重的威胁[6-8]。据流行病学统计显示，我国每年约新增心肌梗死患者60万左右，因此对心肌梗死症状进行及时有效的治疗具有重要意义[9]。

目前临床较为常用的治疗心肌梗死的方法主要包括心肌再灌注治疗、溶栓治疗、抗凝和抗血小板治疗以及冠脉搭桥术治疗等，主要是通过缩小心肌梗死的面积，降低机体心肌受损的程度，从而使心肌梗死导致的死亡率降低，但是治疗的效果并不是很理想[10,11]。目前临床治疗心肌梗死主要使用西药，中药的应用范围相对较小，关于中药对心肌梗死症状治疗效果的研究也较少，本文研究中设计实验，使用黄芪提取物过心肌梗死模型大鼠进行干预，旨在探究其应用价值。

我国传统中医学认为，心肌梗死属于胸瘦心痛范畴，是由于寒邪、正气亏虚等引起，心肌梗死患者常伴有呼吸不畅、心掙、气短、喘促、面色苍白、惊恐不安以及冷汗自出等[12]。黄芪作药用在我国已有两千多年的历史，许多专家学者对黄芪的药用价值进行深入研究，表明黄芪具有补气固表、利尿生肌等作用，对阳气虚弱、气虚乏力、阴虚盗汗等症状有治疗价值[13]。LVPWDd、IVSDd、LVEDD、LVESd、EF、FS是临床较为常用的评价机体心功能的指标，对上述指标进行检测，能够较为直观的反映机体心功能情况[14]。本文研究中对大鼠心功能指标进行检测，结果显示，心肌梗死模型大鼠LVPWDd、IVSDd、LVEDD、LVESd、EF、FS水平相较于正常大鼠出现了明显的异常，使用黄芪提取物进行干预后，心肌梗死大鼠心功能指标水平均受到明显调控而趋近于正常水平，说明使用黄芪提取物能够一定程度上对大鼠心功能进行改善。

cTnI是能够反映心肌损伤和心肌细胞坏死的一种标志物，因为心肌损伤在前期能够很快被释放，所以在血液中的表达不受其他因素影响[15]。cTnI在心肌损伤诊断中具有高特异性和高敏感性，正常人血液中的cTnI水平很低，但是一旦有炎性反应的发生，表达水平就会明显上升。相关报道指出，在还未成熟骨骼肌中能够检测到cTnT，说明cTnT不是心肌的特异性蛋白，而cTnI属于心肌的特异性蛋白，主要的存在场所是心肌收缩蛋白肌丝中，在心肌的收缩和舒张中发挥着重要的调节作用。TGF-β1是一种十分关键的促纤维化生长因子，在机体心肌重构以及纤维化形成过程中发挥着重要作用[16]。韩素霞等[17]在其研究中表明，TGF-β1能够参与冠状动脉粥样硬化的形成、心室重构等过程，在机体心肌梗死后心室重构过程起到关键作用。本文研究结果显示，使用黄芪提取物对心肌梗死模型大鼠进行干预，大鼠心肌组织cTnI、TGF-β1水平受到调控而趋近于正常水平，说明黄芪提取物能够减轻机体心肌损伤程度，促进机体心室重构。

心肌梗死症状常伴随着心肌细胞凋亡，加重心肌损伤程度[18]。Bcl-2和Bax蛋白都属于Bcl-2基因家族，是两种标志性的凋亡蛋白。在功能区分上，Bcl-2是一种凋亡抑制基因，而Bax则是一种凋亡诱导基因，他们能够在决定细胞死亡和生存等问题上起着至关重要的作用。在发挥抑制细胞凋亡功能的时候，Bcl-2与Bax是以二聚体的形式存在，当Bcl-2与Bax形成二聚体后，Bcl-2的凋亡抑制作用便会消失，从而会引起细胞凋亡情况的发生。有研究表明，Bcl-2与Bax蛋白能够单独得起到对细胞凋亡的调节作用，在Bax不存在的时候，Bcl-2可以继续抑制细胞的凋亡，而当Bcl-2不存在的时候，Bax能够继续促进细胞的凋亡[19,20]。本文研究结果显示，使用黄芪提取物对心肌梗死大鼠进行干预后，细胞凋亡相关蛋白p-AKT、Bcl-2及Bax相对表达量受到了明显的调控，说明黄芪提取物能够通过调控细胞凋亡相关蛋白的表达，从而抑制心肌细胞凋亡，减轻心肌损伤程度的作用。

综上所述，黄芪提取物能够有效改善心肌梗死模型大鼠的心功能，抑制心肌细胞凋亡，为心肌梗死症状的临床治疗提供了理论帮助。