二甲双胍对人胸水癌细胞生长的影响

吴雷，孙禹，王玲玲（通讯作者）

（1. 吉林市中心医院 胸外科，吉林 吉林 132011；2. 北华大学附属医院 神经病学中心，吉林 吉林 132011）

0 引言

盐酸二甲双胍是临床糖尿病治疗常用药物。近年来多项研究发现，该药具有抑制肿瘤细胞生长的作用。在流行病学资料也惊奇的发现，糖尿病会增加乳腺癌的患病率，而同时应用二甲双胍治疗的患者这种风险将会大幅度降低，但对于转移性肿瘤的生物学作用尚无定论。本研究以乳腺癌转移胸水内癌细胞为样本，初步探讨二甲双胍对转移性原代肿瘤细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料。提取我院（吉林市中心医院胸外科）乳腺癌患者转移胸水中癌细胞为样本，经患者知情同意后进行细胞原代培养。Hyclone 优质胎牛血清、双抗、RPMI1640 及高糖DMEM（Hyclone 公司）。MTT 及二甲双胍（美国Sigma公司）。DMSO（上海生工）。药敏试验试剂盒（北京生物工程有限公）。

1.2 乳腺癌转移患者胸水癌细胞原代提取培养及肿瘤细胞药敏实验。取患者肝素抗凝胸水200 mL 放入离心管中，加预冷的红细胞裂解液。去上清RPMI 1640 培养基制备单细胞悬液。以2×106/ mL 细胞接种25 cm 培养瓶中培养。待细胞融合达90%时传代及后续实验。准备待测化疗药物：氟尿嘧啶（25 ug/mL）、博来霉素（0.6 ug/mL）、顺铂（3.6 ug/mL）、甲氨碟呤（2.75 ug/mL）、丝裂霉素（0.5 ug/mL）、阿霉素（1 ug/mL），根据待测药物的临床使用计量及其所对应的血浆峰值浓度（PPC），设定6 个检测浓度，即200%、100%、50%、25%、12.5%、6.25%的PPC。每个浓度作2 个平行孔。同时设定MO：无药对照孔；MI：最大抑制孔。应用生物荧光系统（ATP-TCA）进行荧光扫描仪测定及ATP 标准曲线制备，以每个梯度平均荧光值为纵坐标，ATP 含量对数值为横坐标做标准曲线，计算相关系数和变异系数。

1.3 MTT 法绘制细胞生长曲线。将肿瘤细胞以1×104个/mL 接种于96 孔板中，设3 个复孔。盐酸二甲双胍及阿霉素分别干预48 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT 溶液20μl，置于培养箱中继续培养4 h。吸弃各孔内培养液，加入200μl DMSO，孔板避光条件下轻微震荡使结晶充分溶解，在ELX800 酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度（A）值，检测波长490 nm，以全细胞培养液未加细胞的孔调零。记录的结果，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制曲线，对各组细胞生长数量进行对比。

2 结果

2.1 肿瘤细胞药敏实验。使用生物荧光系统（ATP-TCA）测定活细胞指标ATP，进而判断抗肿瘤药物的敏感性和抗性。实验结果显示该肿瘤细胞的中度敏感药物为顺铂、阿霉素；耐药药物为甲氨碟呤、博来霉素、丝裂霉素、氟尿嘧啶，见图1。

图1 体外化疗药物肿瘤生长抑制曲线

2.2 MTT 法比较盐酸二甲双胍、阿霉素对肿瘤细胞生长抑制作用。应用MTT 方法对比分析阿霉素及二甲双胍药品对肿瘤细胞的增长抑制作用，细胞抑制率分别为85%及86.7%，结果显示盐酸二甲双胍优于阿霉素对肿瘤细胞生长抑制作用。见表1。

3 讨论

盐酸二甲双胍作为临床抗高血糖用药治疗2 型糖尿病已经60 多年，现已成为各大国际糖尿病治疗指南中推荐的一线和基础治疗用药[1]。国内外大量流行病学资料[2]、临床研究[3]和动物试验[4]关于二甲双胍抗肿瘤作用的证据层出不穷，但针对转移性肿瘤的研究甚少。本研究中采用乳腺癌转移性胸水中癌细胞为样本，分别应用临床常用抗癌药氟尿嘧啶、博来霉素、顺铂、甲氨碟呤、丝裂霉素、阿霉素进行肿瘤细胞药敏实验，结果发现该细胞系仅存在中度敏感药物顺铂、阿霉素，其余为耐药药物。选择中度敏感药阿霉素与盐酸二甲双胍作为肿瘤抗性药品，应用MTT 方法对肿瘤细胞进行细胞抑制率分析，研究结果发现盐酸二甲双胍优于阿霉素对肿瘤细胞生长抑制作用。关于二甲双胍抑制肿瘤的作用机制研究结果主要集中在凋亡[5-7]及细胞周期[8-10]两个方面。促进细胞凋亡途径包括提高转录因子诱导的细胞自噬作用、增强肿瘤坏死因子相关凋亡配体以及线粒体介导的凋亡现象等，最终导致肿瘤细胞膜结构变化、蛋白质分解、线粒体功能失活以及DNA 降解，抑制肿瘤细胞的增殖。关于细胞周期主要通过调节CDl、E2F1、CDK4、p21、p27 等细胞周期关键蛋白，将肿瘤细胞周期阻滞在G0/G1 期。另外也有学者认为二甲双胍的抗肿瘤作用机制可能与其直接调控细胞代谢有关，也可能与其降低胰岛素等激素水平有关[11]。二甲双胍有可能通过激活AMPK 酶，导致癌细胞得不到足够的细胞信号来分裂而直接发挥抗肿瘤作用[12]。目前肿瘤机制研究、肿瘤药物靶向治疗以及新药开发是肿瘤学及药理学的研究热点，盐酸二甲双胍是否可以扩大临床应用范围，或者作为2 型糖尿病合并肿瘤疾病患者的首选辅助药品有待于进一步探讨及临床大数据的跟踪报道。

表1 细胞生长抑制率