酶法处理油茶籽壳制备低聚木糖工艺的优化

张立钊 ，卢昌丽，陈力力 *，熊香元 ，龚慧可

1. 湖南农业大学食品科技学院（长沙 410128）；2. 食品科技和生物技术湖南省重点实验室（长沙 410128）；3. 湖南省发酵食品工程技术研究中心（长沙 410128）

油茶籽壳中的纤维素、木质素、半纤维素、蛋白质、脂肪和茶皂素等含量较高，含量分别是23.45%，21.56%，9.70%，3.24%，3.69%和5.17%，将这些植物纤维素废料经水解则可制得低聚木糖[1]。生产低聚木糖的植物性原料种类多样，数量众多，通常如玉米芯、甘蔗渣、稻壳及其他种子皮壳禾杆等都是制取低聚木糖的理想原料[2]，由此看出油茶籽壳也可以作为原材料制取低聚木糖。随工业发展，将副产物油茶籽壳作为原料可以生产出醋酸钠、拷胶、单宁等化学物质[3]，而油茶籽壳被使用于生产低聚木糖却很少见。

将木聚糖经过物理或化学方法降解可形成低聚木糖，彻底反应可得单糖，其中大部分为木糖。低聚木糖是2～10个木糖分子形成低度聚合五碳糖的总称，又称木寡糖[4]。低聚木糖用途非常广泛，主要用于生产木糖醇或饲料，在多个工业部门被广泛应用：在医药工业，低聚木糖可以治疗高血压、高血脂、糖尿病和肝炎等，还可以生产血浆保存剂，具有防蛀牙的作用；在化工工业上，低聚木糖可用于生产燃料、增塑剂、油漆涂料；在食品工业中，低聚木糖可作为甜味剂、风味改良剂、抗氧剂和其他香精料等[5]。

试验开展碱预处理方法，制备油茶籽壳木聚糖及其酶解处理制备低聚木糖的研究，旨在为提高油料加工副产物油茶籽壳的附加值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油茶籽壳：产自广西百色地区，剔除杂质后籽壳分离，将茶籽壳40 ℃烘至恒质量，打成壳粉（200目筛）后，进行真空包装，放置冰箱冷藏贮存备用。

木聚糖酶（酶活6 000 U/mg，上海广锐生物科技有限公司）；D-木糖（上海瑞永生物科技有限公司）；浓氨水、酒石酸钾钠、酚酞、浓硫酸、氢氧化钠、苯酚、亚硫酸钠等（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

101-2AB电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；XMTD-4000电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；SW-CJ-1FD无菌操作台（苏州净化设备有限公司）；AUY220电子天平（岛津制作所）；LDZX-50KBS立式高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；722N分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 测定指标及测定方法

木聚糖、低聚木糖的测定：采用DNS法[6]，提取率及低聚木糖浓度计算参考文献[7]。

1.3.2 碱法制备木聚糖粗提液

称取50 g制备的油茶籽壳壳粉，倒入1 000 mL锥形瓶中，并加入5%氨水，控制固液比1∶10（g/mL），在60 ℃的恒温条件下浸泡12 h；随后过滤留下滤渣，用自来水反复冲洗，直至洗液清澈。将上述滤渣再加入蒸馏水，使固液比1∶10（g/mL），放置于170 ℃下密封并蒸煮2 h，过滤收集滤液，测定木聚糖的含量。采用旋转蒸发仪浓缩达到适当浓度。

1.3.3 酶法制备低聚木糖单因素试验

取5 mL木聚糖粗提液，以木聚糖作为底物，用木聚糖酶进行酶解。以酶添加量3%、酶解时间6 h、酶解温度50 ℃、底物浓度5 g/L作为基础酶解条件。以低聚木糖浓度为考核指标，对酶添加量（1%，2%，3%，4%和5%）、酶解时间（2，4，6，8和10 h）、酶解温度（40，45，50，55和60 ℃）和底物浓度（5，10，15，20和25 g/L）4个因素进行单因素试验，考察各因素对低聚木糖浓度的影响。

1.3.4 酶法制备低聚木糖响应面优化

在单因素试验结果基础上，以低聚木糖浓度（Y）为响应值，选取酶添加量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）和底物浓度（D）4个因素进行响应面试验以优化酶解工艺[8]，Box-Behnken试验因素与水平见表1，试验设3次重复。

表1 油茶籽壳酶解制备低聚木糖响应面试验因素水平表

1.3.5 数据处理

采用Excel软件进行绘图和数据处理，采用SPSS 19.0软件进行差异性显著性分析，响应面试验数据采用Design Expert 8.0.6软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 木聚糖粗提液提取率

通过碱法处理，获得木聚糖粗提液，其浓度为5.15 g/L，提取率为53.12%。经浓缩，得到10，15，20和25 g/L不同浓度的木聚糖原液。

2.2 酶解制备低聚木糖单因素结果比较

2.2.1 酶使用量对低聚木糖提取的影响

从图1可以发现，一开始随着木聚糖酶量的增加，浓度曲线快速升高，木聚糖酶使用量4%时，低聚木糖浓度达到最高峰值，之后随着木聚糖酶使用量加大，曲线变化趋势不明显，且有下降趋势。在一定情况下，越多的木聚糖酶就有越高产物浓度，曲线图几乎呈线性相关。但是，酶使用量增加到糖降解反应彻底时，线性关系被打破，低聚木糖浓度曲线不再升高，若此时继续添加木聚糖酶，会造成不必要的浪费。因此4%是木聚糖酶的最适添加量，此条件下酶解后低聚木糖浓度为4.25 g/L。

图1 不同酶使用量对低聚木糖浓度的影响

2.2.2 酶解时间对低聚木糖提取的影响

试验结果如图2所示。在8 h内随着反应时间的不断加大，低聚木糖浓度曲线不断上升，8 h时浓度达到最大值，之后浓度呈下降趋势。随着反应不断进行，低聚木糖浓度不断增加，使得对正反应的抑制作用不断增强。而且，刚开始进行反应时，酶与无定形区的纤维素更容易反应并催化水解，但继续反应难以渗透到结晶区，在结晶区的纤维素分子慢速水解，产物浓度增加缓慢。因此，酶解最适反应时间是8 h，此条件下酶解后低聚木糖浓度为3.69 g/L。

2.2.3 酶解温度对低聚木糖提取的影响

试验结果如图3所示。低聚木糖浓度随着反应温度梯度的增大而明显增大，50 ℃时浓度到达最大峰值，温度大于50 ℃后浓度曲线几乎呈直线下降。这是由于反应温度对酶有很强的敏感性，其会影响自身的蛋白稳定性和催化能力。温度过低，反应中木聚糖酶催化降解过程受到抑制；温度过高，影响木聚糖酶蛋白稳定性，也加快酶活力下降的速度，使反应不能彻底。因此，选择酶解温度50 ℃为最适温度，此条件下酶解后低聚木糖浓度为3.68 g/L。

图2 不同酶解时间对低聚木糖浓度的影响

图3 不同酶解温度对低聚木糖浓度的影响

2.2.4 底物浓度对低聚木糖提取的影响

从图4可以发现，一开始随着底物浓度增加，低聚木糖浓度曲线逐渐升高，底物浓度25 g/L时低聚木糖浓度达到最高峰值，之后随着加大底物浓度，曲线变化趋势不明显，且有下降趋势。在一定情况下，越高底物浓度就有越高产物浓度，底物浓度增加到所有酶都参与糖降解反应时，线性关系被打破，低聚木糖浓度曲线不再升高，若继续提高底物浓度，会造成不必要的浪费。因此选择底物浓度20 g/L为最适浓度，此条件下酶解后低聚木糖浓度为10.60 g/L。

2.3 木聚糖酶解工艺响应面优化试验结果

根据单因素试验结果，以低聚木糖浓度（Y）为响应值，选取酶添加量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）、底物浓度（D）4个因素进行响应面试验优化酶解工艺，选取四因素三水平的Box-Behnken试验，试验设计结果见表2，方差分析见表3。

通过Design Expert 8.0.6软件对29组试验的响应值进行回归分析，并进行回归方程拟合，得到各试验因子对响应值影响的多元二次回归方程：Y=81.54+5.81A-0.057B-0.58C-6.11D-2.500E-003AB+0.027AC+2.90AD-0.12BC+0.19BD+0.17CD+0.52A2-0.38B2-4.00C2+0.84D2。

不同因素以及其不同水平处理对低聚木糖浓度的影响较大，线性范围在4.52～11.52 g/L之间，因此优化各因素组合能显著提高低聚木糖浓度。

由表3可知，模型p＜0.000 1，说明回归模型效果极显著[9]。模型失拟项p值为0.072 8＞0.05，失拟项不显著，说明模型比较稳定，拟合良好，误差小。此模型可以包括所有试验数据，并且可以忽略试验误差。决定系数R2=0.994 6，校正决定系数R2adj=0.989 2，表明模型可以解释试验98.92%的响应值变化。一次项A、C、D，二次项A2、C2对结果影响极显著（p＜0.01），交互项AD、AC对结果影响显著（p＜0.05）。

表2 Box-Behnken试验设计及结果

表3 响应面试验方差分析

图5 酶添加量和底物浓度的交互作用对低聚木糖浓度的影响

图6 酶添加量和酶解温度的交互作用对低聚木糖浓度的影响

通过Design Expert 8.0.6软件分别作出酶添加量、酶解时间、酶解温度、底物浓度交互作用的响应曲面，结果见图5和图6。曲面图越陡表示交互作用越强，曲面图越平表示交互作用越弱。由图5可知，酶添加量和底物浓度的交互作用对于低聚木糖浓度有显著影响，由三维图可以看出，低聚木糖浓度的变化均是随两者的增加而增加的，最高的低聚木糖浓度出现在酶添加量为5%附近，对应的底物浓度为2%。由图6可知，酶添加量和酶解温度的交互作用对低聚木糖浓度的影响显著，酶解温度对低聚木糖浓度的影响比酶添加量更大。

通过Design Expert 8.0.6软件分析得到最佳酶解工艺条件：酶添加量5%、酶解时间10 h、酶解温度49.05℃、底物浓度20 g/L。此时低聚木糖浓度理论预测值为11.596 2 g/L。结合试验实际情况，最终选择酶添加量5%、酶解时间10 h、酶解温度49 ℃、底物浓度20 g/L。为了验证模型的准确性，采取优化后的酶解条件做验证试验，设3次平行，低聚木糖浓度实际平均值为11.63 g/L，与理论预测值基本一致。

3 结论

主要对木聚糖酶解工艺进行优化，通过单因素试验研究酶添加量、酶解时间、酶解温度、底物浓度对低聚木糖浓度的影响，选取较优条件范围，在单因素试验基础上，设计响应面试验，以低聚木糖浓度为考核指标，优化酶解条件：酶添加量5%、酶解时间10 h、酶解温度49 ℃、底物浓度2%。此优化条件下，低聚木糖浓度为11.63 g/L，比未优化前提高4.63 g/L。试验证明碱法提取木聚糖制备低聚木糖的可行性，可对企业的实际工业化生产低聚木糖提供理论依据。